鄭　松，王殿超，張　磊

甲基化CpG結合蛋白(methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)是一種甲基化調(diào)控蛋白，能夠特異性與甲基化DNA結合，形成復合物來抑制目的蛋白轉錄。眾多文獻[1-2]報道，MeCP2能夠通過調(diào)控甲基化水平參與細胞的增殖、遷移、凋亡等多種生理病理過程。研究[3]表明MeCP2可以通過PTCH1/GLIS1通路調(diào)控人急性單核細胞白血病單核細胞株分泌白介素(interleukin, IL)-6和腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor, TNF)-α的表達，但是MeCP2在炎癥性肺病中的作用未見報道。該研究通過siRNA沉默等技術抑制MeCP2的表達，探討其對小鼠肺泡巨噬細胞小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)分泌炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用，為炎癥性肺病提供基礎研究。

1　材料與方法

1.1實驗材料脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Opti-MEM購自美國Gibco公司; Lipofectamine 2000 Reagent和TRIzol購自美國Invitrogen公司；Reverse Transcription System逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；TransStart Tip Green qPCR Super Mix購自北京全式金生物技術有限公司；RIPA裂解液和胰酶細胞消化液購自上海碧云天生物技術研究所；小鼠抗β-actin抗體購自美國 Santa Cruz公司；MeCP2抗體購自美國abcam公司；p-p65、p65、p-IκBα和IκBα抗體購自美國Cell signaling公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2實驗器材MK3型酶標儀購自荷蘭雷勃公司；Bio-rad電泳儀購自美國伯樂公司；PCR擴增儀購自德國Eppedorf公司；實時熒光定量PCR儀購自美國賽默飛公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3方法

1.3.1MH-S細胞培養(yǎng)小鼠肺泡巨噬細胞MH-S細胞購自上海中國科學院細胞庫。使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2和濕度飽和條件下培養(yǎng)，細胞生長到80%～90%時進行傳代。

1.3.2MeCP2-siRNA轉染到MH-S取對數(shù)期MH-S細胞，用含10%胎牛血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為(1.0～2.0)×105/ml接種于培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基后用PBS洗3次；16 μl的siRNA與8 μl LipofectamineTM2000分別用500 μl Opti-MEM稀釋,且孵育5 min后混合，室溫靜置20 min后加入培養(yǎng)瓶中，補Opti-MEM到4 ml后常規(guī)培養(yǎng)，8 h后換成10%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后期實驗。MeCP2-siRNA序列：5′-GCUUCCCGAUUAACUGAAA TT-3′; 5′-UUUCAGUUAAUCGGGAAGCTT- 3′。

1.3.3Q-PCR法檢測MeCP2 、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達采用TRIzol法提取MH-S細胞總RNA，逆轉得到cDNA。根據(jù)TransStart Tip Green qPCR Super Mix說明書混合MeCP2、IL-1β、IL-6和TNF-α引物和SYBR Green，使用Q-PCR儀檢測MeCP2、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達。見表1。

表1　基因引物序列

1.3.4Western blot法檢測MeCP2、p-p65、p65、p-IκBα和IκBα的蛋白表達取處理后的MH-S細胞，加入400 μl的RIPA(含100 mmol/L PMSF)細胞裂解液，置于冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min，離心30 min；取上清液加入SDS蛋白上樣緩沖液99.9 ℃變性10 min。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過電轉移將蛋白與PVDF膜結合上，在5%脫脂牛奶中封閉3 h；TBST清洗3次，每次15 min；一抗4度孵育過夜后，TBST洗3次后二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后ECL發(fā)光試劑盒顯影。一抗?jié)舛葹椋篗eCP2 (1 ∶500)、p-p65 (1 ∶500)、p65 (1 ∶1 000)、p-IκBα (1 ∶500)和IκB (1 ∶1 000)；二抗?jié)舛染鶠? ∶10 000。用ImageJ軟件分析，以β-actin為內(nèi)參。

1.3.5ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達收集處理后的MH-S細胞上清液，3 000 r/min，離心20 min；取上清液于1.5 ml EP管內(nèi)保存。按照試劑盒說明書步驟檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白含量。

2　結果

2.1LPS誘導MH-S細胞對IL-1β、IL-6和TNF-α表達的影響使用不同濃度的LPS刺激MH-S后，如圖1所示，Q-PCR檢測顯示IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平隨著LPS濃度的增加而增加(F=36.89、18.34、21.77，P<0.01,P<0.05)；ELISA結果同樣表明MH-S細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平隨著LPS濃度的增加而增加(F=42.83、32.37、30.81，P<0.05)。后續(xù)實驗中選取LPS濃度為1 000 ng/ml作為刺激MH-S濃度。

圖1　LPS誘導MH-S細胞對IL-1β、IL-6和TNF-α表達的影響

A：LPS誘導MH-S細胞的IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達；B：LPS誘導MH-S細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達；1：0 ng/ml LPS；2：125 ng/ml LPS；3：250 ng/ml LPS；4：500 ng/ml LPS；5：1 000 ng/ml LPS；6：2 000 ng/ml LPS；與0 ng/ml LPS比較：#P<0.05,##P<0.01

2.2LPS誘導MH-S細胞對MeCP2表達的影響使用不同濃度的LPS刺激MH-S細胞后，如圖2所示，Q-PCR檢測顯示MeCP2 mRNA的表達水平隨著LPS濃度的增加而增加(F=19.28，P<0.01)；Western blot結果顯示MeCP2蛋白水平同樣隨著LPS濃度的增加而增加，且差異有統(tǒng)計學意義(F=13.21，P<0.01)。提示MeCP2可能與MH-S細胞分泌炎癥因子有關。

2.3MeCP2-siRNA抑制LPS誘導MH-S對IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響為了研究MeCP2在MH-S細胞中的作用，使用MeCP2-siRNA沉默MH-S中MeCP2的表達，分組分別為Scrambled-RNAi組，LPS+Scrambled-RNAi和LPS+MeCP2-siRNA組，如圖3所示，MeCP2-siRNA顯著降低了MH-S細胞中的mRNA和蛋白的表達水平，且差異有統(tǒng)計學意義(F=22.87、11.29，P<0.05)。同時使用Q-PCR和ELISA方法檢測顯示，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和分泌蛋白水平明顯下降(P<0.05)。提示抑制MeCP2表達能夠抑制LPS誘導MH-S分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。

圖2　LPS誘導MH-S細胞對MeCP2表達的影響

A：LPS誘導MH-S細胞中MeCP2基因表達；B：LPS誘導MH-S細胞中MeCP2蛋白表達；1：0 ng/ml LPS；2：125 ng/ml LPS；3：250 ng/ml LPS；4：500 ng/ml LPS；5：1 000 ng/ml LPS；6：2 000 ng/ml LPS；與0 ng/ml LPS比較：##P<0.01

2.4MeCP2-siRNA抑制MH-S對p-p65和p-IκBα蛋白表達的影響為了研究MeCP2如何抑制MH-S分泌炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，分組分別為Scrambled-RNAi組，LPS+Scrambled-RNAi和LPS+MeCP2-siRNA組，使用Western blot檢測NF-κB通路顯示，p-p65和p-IκBα的蛋白表達顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05)。提示MeCP2有可能是通過抑制NF-κB通路，進而抑制LPS誘導MH-S分泌炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。見圖4。

圖3　MeCP2-siRNA抑制LPS誘導MH-S中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響

A：MeCP2-siRNA抑制MH-S中MeCP2 mRNA表達；B：MeCP2-siRNA抑制MH-S中MeCP2蛋白表達；C：MeCP2-siRNA抑制LPS誘導MH-S中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達；D：MeCP2-siRNA抑制LPS誘導MH-S分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達；1：Scrambled-RNAi；2：LPS+ Scrambled-RNAi；3： LPS+MeCP2-siRNA；與Scrambled-RNAi比較：##P<0.01；與LPS+Scrambled-RNAi比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4　MeCP2-siRNA抑制MH-S對p-p65和p-IκBα蛋白表達的影響

1：Scrambled-RNAi；2：LPS+Scrambled-RNAi；3： LPS+MeCP2-siRNA；與Scrambled-RNAi組比較：##P<0.01；與LPS+Scrambled-RNAi組比較：*P<0.05，**P<0.01

3　討論

炎癥性肺病是由于肺外各種致病因素導致肺及支氣管內(nèi)大量巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，釋放大量炎癥介質進而引起肺內(nèi)炎性介質和抗炎介質失衡造成的肺臟疾病，如支氣管哮喘、急性肺損傷等[4-5]。因此進一步研究炎癥性肺病的發(fā)病機制、尋找新的防治靶點仍然是研究的重點。肺泡巨噬細胞是肺內(nèi)固有的巨噬細胞[5]，能夠在異物刺激時分泌大量炎癥因子，在清除有害物質中發(fā)揮關鍵作用。研究[6]表明，肺泡巨噬細胞受到LPS、干擾素-γ等刺激后，能夠分泌大量炎癥因子，如TNF-α、IL-6和IL-1β等，能夠直接損傷血管內(nèi)皮細胞，增加血管通透性，引起水腫等。如何抑制肺泡巨噬細胞的炎癥因子釋放成了治療和控制炎癥性肺部的關鍵。

本文研究顯示，小鼠肺泡巨噬細胞MH-S受到LPS刺激后，炎癥因子和MeCP2表達同時升高，說明MeCP2可能與MH-S細胞分泌炎癥因子有關。同時研究[3]表明MeCP2能夠抑制肝臟內(nèi)巨噬細胞分泌IL-6和TNF-α的表達，提示MeCP2與巨噬細胞分泌炎癥因子有著密切關系。本文又通過siRNA沉默技術特異性沉默MeCP2表達后，Q-PCR和ELISA檢測顯示TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA和蛋白表達顯著降低，說明可以通過抑制MeCP2的表達來降低肺泡巨噬細胞的炎癥因子釋放。

外源性微生物產(chǎn)生的LPS為Toll樣受體4的外源性配體[7]，能夠激活NF-κB通路，促進各種炎癥因子的表達。在靜息的細胞中，NF-κB與IκB形成復合物，以無活性形式存在于胞質中[8]。當細胞受到刺激，IκB被磷酸化，暴露NF-κB的核定位點p65，p65被磷酸化后迅速進入細胞核，從而引起一系列的炎癥因子分泌。NF-κB是具有廣泛調(diào)節(jié)作用的核轉錄因子[9]，因此，NF-κB 信號通路是炎癥性肺病最受關注的信號轉導系統(tǒng)之一。本文研究顯示抑制MeCP2后，p-p65和p-IκBα表達明顯降低，提示，MeCP2抑制MH-S細胞釋放炎癥因子，可能是通過抑制NF-κB的活化。

綜上所述，本研究結果首次證明MeCP2在MH-S細胞中具有重要作用，抑制MeCP2表達能夠抑制LPS刺激MH-S細胞分泌炎癥因子，可能是通過抑制NF-κB的活化，但具體機制尚需進一步研究。