王獻路，婁　寅，陳增紅，曹東升

嬰幼兒血管瘤(infantile hemangiomas, IHs)是嬰幼兒時期最常見的良性腫瘤，全世界范圍內的發(fā)病率高達4%～10%[1]。2008年，Léauté-Labrèze et al[2]發(fā)現普萘洛爾(Propranolol, PRN)可對IHs產生治療效果。時至今日，PRN已漸漸替代激素成為治療IHs的一線藥物。同樣在2008年，血管瘤干細胞(hemangioma stem cells, HemSCs)被Khan et al[3]首次報道，并在裸鼠上重建了獨特的IHs演變過程，提示HemSCs可能是IHs的來源細胞。近年來，關于PRN治療IHs的研究大多數是圍繞HemSCs開展的，取得了一些成果[4-5]，但是對于其治療機制尚無突破性進展。IHs的自然發(fā)展最終是以纖維脂肪組織出現代替增生的血管組織為特征性表現的，臨床上也發(fā)現，使用PRN治療IHs數月后再次行手術切除的患兒，術中切除的瘤體組織表淺面呈現IHs特征性的鮮紅色圓形凸起，但深部會有大量脂肪組織存在，與消退階段出現大量脂肪細胞的特征相似，但時間進程上卻大大提前。由此推測，PRN可能是通過影響HemSCs向脂肪細胞分化從而治療血管瘤的。該研究通過對HemSCs進行體外提取與培養(yǎng)，檢測PRN干預HemSCs時脂化相關因子的變化，旨在為IHs的治療提供新的思路與方法。

1　材料與方法

1.1血管瘤標本經安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，征得患兒家屬同意并簽署知情同意書后，收集安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院整形外科手術切取的未進行任何治療的增殖期血管瘤新鮮標本，共2例，經安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科確診為增殖期血管瘤。HemSCs的獲取依據Khan et al[3]的方法，從增生期血管瘤組織中分離并培養(yǎng)，取第4～10 代血管瘤干細胞進行實驗。

1.2主要試劑與儀器MS分選柱、CD133免疫磁珠試劑盒(德國Miltenyi公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司)；鹽酸普萘洛爾(美國Sigma公司)；鼠抗人CD31、CD90、CD105抗體(美國Biolegend公司)；胎兒骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒、油紅O染色試劑盒(廣州賽業(yè)生物科技公司)；Real Time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；脂肪分化指標的一抗(C /EBPα、C /EBPβ、PPARγ)(武漢博士德生物公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國Beckman公司)；Real Time PCR儀(美國ABI公司)。

1.3血管瘤干細胞的分選與培養(yǎng)手術切取新鮮增殖期血管瘤組織，立即浸入4 ℃的DMEM/20%胎牛血清(FBS)+1%青霉素-鏈霉素(PS)的培養(yǎng)基中，然后迅速送到實驗室。大量的PBS沖洗標本后，剪除皮膚、脂肪、血凝塊及其他非瘤體組織，并留取明確的血管瘤組織。將未經處理的血管瘤組織用剪刀切碎成小組織塊，浸入0.2%膠原酶中，37 ℃水浴箱中消化約1.5～2 h，棄上清液，DMEM重懸，通過100 μm的細胞濾網過濾后獲得單細胞懸液。加入CD133磁珠，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗，棄上清液，重懸后，流入分選柱，通過CD133標記的免疫磁珠技術提純CD133(+)HemSCs，收集細胞，然后培養(yǎng)于EGM-2/20%FBS+ 1%PS培養(yǎng)基中。通過細胞計數法計算HemSCs提取率[6]。培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液，去除漂浮的細胞和未標記的磁珠。當原代細胞匯合成片鋪滿培養(yǎng)瓶時，用胰蛋白酶消化技術培養(yǎng)HemSCs并在體外傳代培養(yǎng)。第4～10代HemSCs用于實驗研究。

1.4形態(tài)學觀察通過倒置顯微鏡，觀察HemSCs接種在96孔培養(yǎng)板上24 h和48 h后細胞的形態(tài)。隨著細胞代數的增加，可以觀察到HemSCs的形態(tài)學的改變。

1.5流式細胞術鑒定血管瘤干細胞使用PE小鼠抗人CD31、CD90、CD105抗體進行檢測。收集第3代HemSCs，細胞濃度調整為1×107個/ml。離心管為對照，CD31、CD90、CD105，加入500 μl細胞懸液，后加入5 μl相應抗體，4 ℃避光孵育30 min。清洗細胞2次后加入600 μl PBS，然后通過流式細胞術進行上機檢測。Cytomics CXP軟件分析數據。

1.6油紅O染色檢測HemSCs的成脂轉化收集對數生長期的HemSCs,調整HemSCs濃度為1×105個/ml,接種于6孔板中。隔天換液待HemSCs生長到90%融合，用培養(yǎng)基A液即誘導培養(yǎng)基將PRN稀釋成不同濃度(50 μmol/L、100 μmol/L)，替換原培養(yǎng)液，對照組加入培養(yǎng)基A液，實驗組加入不同濃度的PRN溶液，3 d后更換為培養(yǎng)基B液即基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基A液繼續(xù)誘導。培養(yǎng)基A液和B液交替培養(yǎng)至脂滴變得足夠大而圓后，PBS沖洗，4%中性甲醛溶液固定30 min后,再次PBS沖洗，加入1 ml油紅O染料工作液30 min，棄去油紅O染液，用PBS沖洗后顯微鏡下觀察細胞成脂染色效果并拍照。

1.7RealTimePCR法檢測HemSCs脂肪分化的相關指標提前染毒HemSCs(對照組和實驗組，實驗組：50 μmol/L、100 μmol/L PRN溶液)，用TRIzol溶液提取RNA。將提取的總RNA，反轉錄試劑盒，RNase Free dH2O置于冰上，按照試劑盒說明書進行操作，反轉錄為cRNA。在Pubmed上選擇Gene數據庫搜索相關基因，以人ACTB 內參引物(NO. B661102)作為內參照,PCR引物序列見表1。以cDNA 鏈為模板進行PCR 反應，進行兩步法PCR擴增標準程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，擴增40個循環(huán)。反應結束后，確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，分析結果。

表1　PCR使用引物列表

1.8Westernblot法檢測HemSCs脂肪分化的相關指標提前染毒HemSCs(對照組和實驗組，實驗組：50 μmol/L、100 μmol/L PRN溶液)，RIPA裂解液裂解并提取蛋白質，BCA法蛋白定量后，SDS-PAGE電泳分離，電泳條件：60 V、30 min；120 V、1.5 h。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1～4 h，TBST洗膜3次，每次10 min，一抗室溫孵育1～3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育1～3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，化學發(fā)光，顯影。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，組間顯著差異采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HemSCs的提取率使用CD133免疫磁珠分離技術，從嬰幼兒增殖期血管瘤標本中分離出HemSCs，運用細胞計數法計算HemSCs提取率分別為0.27%和0.18%(樣品1和2)，平均約0.36%。

2.2HemSCs的形態(tài)觀察HemSCs接種在96孔板中，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，顯示細胞呈圓形，同時可看到許多圓形透亮的未標記CD133的免疫磁珠。24 h后再次觀察，顯示圓形細胞開始變成橢圓形，長條形，形狀多樣且不規(guī)則(圖1A)。48 h后，不規(guī)則形狀的細胞已經變成長梭形擴散于孔板中(圖1B)，同時可看到許多圓形透亮的未標記CD133的免疫磁珠和大量未貼壁的死細胞。形態(tài)學觀察表明，HemSCs的形態(tài)呈長梭形，類似于間充質干細胞的形態(tài)。其中第4代HemSCs細胞排列呈螺旋形漩渦狀排列(圖1C)。隨著代數的增加，HemSCs的形態(tài)從長主軸變?yōu)槿切危倪呅魏筒灰?guī)則形狀。第8代HemSCs仍然具有強大的增殖和集落形成能力(圖1D)。

2.3流式細胞術檢測細胞表型流式細胞術結果表明提取的細胞高度表達CD90(98.8%)和CD105(97.8%)，但不表達CD31(0.7%)(圖2)，符合HemSCs的細胞表型。

2.4HemSCs的成脂誘導和油紅O染色油紅染色顯示，HemSCs在脂肪培養(yǎng)基培養(yǎng)12～15 d后，細胞質內有許多紅色脂滴形成。對照組的紅色脂滴數較實驗組少，且體積偏小，像花環(huán)一樣圍繞著細胞核一圈。而實驗組細胞質內的紅色脂滴像葡萄串樣聚集在一起，形狀更圓更大(圖3)。且隨著PRN濃度的上升，100 μmol/L組較50 μmol/L組細胞質內紅色脂滴數量有增加趨勢(圖3B、3C)。另外還觀察到實驗組與對照組相比，HemSCs的數目和密度有減少趨勢(圖3A、3C)。

圖1　血管瘤干細胞形態(tài)觀察　SP×100

圖2　流式細胞術檢測血管瘤干細胞表型

圖3　血管瘤干細胞的成脂誘導和油紅O染色　SP×200

圖4　Real Time PCR檢測各組C /EBPα、PPARγ和C /EBPβ表達情況

圖5　Western blot法檢測各組C /EBPα、PPARγ和C /EBPβ的表達情況

2.5RealTimePCR法檢測HemSCs脂肪分化的相關指標C /EBPα指標在50 μmol/L PRN溶液干預后，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是在100 μmol/L PRN溶液干預后，與對照組相比RNA水平上升，是對照組的3.2倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PPARγ和C/EBPβ指標經50 μmol/L和100 μmol/L PRN溶液干預后，與對照組相比RNA水平都顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

2.6Westernblot法檢測HemSCs脂肪分化的相關指標HemSCs經不同濃度PRN溶液干預后，Western blot法檢測HemSCs脂肪分化相關指標蛋白表達水平改變趨勢與Real Time PCR法檢測HemSCs脂肪分化相關指標RNA水平變化相一致(圖5)。

3　討論

IHs是兒童時期最常見的良性血管腫瘤,由紊亂的血管和不成熟的血管細胞組成。2008年PRN治療血管瘤被發(fā)現，經過近十年的大量研究，PRN已經代替激素成為治療IHs的突破性治療方法。但是關于其治療機制仍然不清楚。在此之后，HemSCs被Khan et al[3]從血管瘤瘤體組織中成功分離，并重建了獨特的IHs演變過程，學者們才把目光集中到HemSCs的研究上來。Boye et al[7]認為血管瘤是HemSCs分化為內皮細胞的表型而形成。

IHs的生物過程復雜，有自行消退的特點，通常表現為3個不同的階段，即增殖階段、消退階段以及消退完成階段[8]。消退完成時，其特征性表現是纖維脂肪組織包繞塌陷的血管結構，這些獨特的生理特點明顯區(qū)別于血管畸形。Khan et al[3]在進行HemSCs研究時也發(fā)現，HemSCs在消退期會分化為脂肪細胞。脂化通常與C/EBPα、C/EBPβ以及PPARγ這3種因子相關。當特定細胞接收到脂肪轉化相關信號后，轉錄因子C/EBPβ表達增加，誘導C/EBPα和PPARγ上調，促進與脂肪形成有關的基因表達增加，加速脂化過程。

本研究中，參考Khan et al[3]的HemSCs分選培養(yǎng)方法，并稍作修改，使膠原酶的消化時間從30 min延長至1.5～2 h，目的是為了提高單細胞懸液的質量，進而提高HemSCs的提取產率。而后采用流式細胞術檢測其細胞表型，細胞高度表達干細胞標志物CD90和CD105，但不表達血管瘤內皮細胞標志物CD31，證實培養(yǎng)的細胞為HemSCs。HemSCs經成脂誘導分化培養(yǎng)基作用后，油紅染色顯示細胞質內有許多紅色脂滴形成，并且實驗組內的紅色脂滴與對照組相比數量多且形狀更大更圓，證實HemSCs有向脂肪細胞分化的潛能，并且PRN干預后，加速了HemSCs的脂化。隨后用Real Time PCR法和Western blot法檢測不同濃度PRN溶液干預下HemSCs脂化相關指標的變化，結果顯示PPARγ和C/EBPβ指標經50 μmol/L和100 μmol/L PRN溶液干預后，與對照組相比RNA及蛋白水平都顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義。C /EBPα指標在50 μmol/L和100 μmol/L PRN溶液干預后，與對照組相比，趨勢不一致。雖然C /EBPα在50 μmol/L PRN溶液干預下相比于對照組RNA水平有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義，C /EBPα在100 μmol/L PRN溶液干預后，與對照組相比RNA水平上升，差異具有統(tǒng)計學意義。這些結果與成脂誘導分化后油紅O染色結果相一致，從側面驗證了實驗的假設。

IHs的發(fā)生在臨床上很常見，不僅給患兒帶來了生理和心理上的巨大的痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。此次的研究成果有助于揭示PRN治療IHs的機制，也將為臨床上更好的運用PRN治療血管瘤提供理論新依據。

參考文獻