陳偉娜，李春梅，朱仲珍，蔡　莉，李　榮

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫性疾病,主要以慢性滑膜炎癥、軟骨和骨質(zhì)破壞為特征。RA關(guān)節(jié)軟骨細胞功能異常，喪失了合成、修復(fù)軟骨基質(zhì)的能力而導(dǎo)致軟骨損傷，軟骨損傷與RA嚴重程度和預(yù)后密切相關(guān)，保護軟骨功能可以有效降低RA致殘率[1]。迄今為止，水通道蛋白(aquaporins, AQPs)已在哺乳動物中鑒定和克隆出13種AQPs (AQP0～12)亞型，顧名思義，都是與水通透性相關(guān)的膜蛋白。研究[2-4]表明AQP1在RA疾病進展中發(fā)揮重要作用：AQP1在RA患者滑膜和關(guān)節(jié)軟骨組織中均表達升高，AQP1能調(diào)節(jié)軟骨細胞體積和基質(zhì)合成，與RA軟骨損傷、關(guān)節(jié)積液、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)腫脹等密切相關(guān)，調(diào)控AQP1的表達和功能可能是RA的潛在治療靶點。該研究使用炎癥因子白介素(intertleukin，IL)-1β誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞致其損傷作為軟骨細胞凋亡的體外模型，觀察AQP1抑制劑乙酰唑胺(acetazolamide, AZ)對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡的影響，并從影響凋亡相關(guān)基因表達和NF-κB通路探討其可能機制，為防治RA尤其是保護RA關(guān)節(jié)軟骨提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物Sprague-Dawley大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，清潔級，雄性，2～3周齡，100～120 g。

1.2藥物與試劑AZ、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；IL-1β(美國PeproTech公司)；Rhodamine-123(北京索萊寶科技公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；MTT、Hoechst 33258 染色液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；所有抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.3軟骨細胞的分離培養(yǎng)與鑒定參考文獻[5]方法，分離大鼠膝關(guān)節(jié)表面軟骨，37 ℃下胰酶和0.2% Ⅱ型膠原酶分別消化30 min和3 h；200目濾網(wǎng)過濾,1 500 r/min離心10 min，PBS清洗，收集細胞；加入含10%胎牛血清的DMEM吹打均勻后移入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48 h，換液，除去未貼壁細胞，當原代培養(yǎng)的細胞連成片時進行消化傳代。本實驗中所用細胞為傳1～3代的關(guān)節(jié)軟骨細胞，采用光鏡下觀察細胞形態(tài)、Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色和蛋白多糖甲苯胺藍染色等進行軟骨細胞的鑒定。

1.4MTT法檢測細胞增殖收集大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞，制成單細胞懸液，接種于96孔板(密度5×108/L)，分為6組：正常組，IL-1β誘導(dǎo)組(終濃度10 mg/L，濃度參考文獻[6])，AZ體外給藥組(終濃度分別為12.5、25、50、100 μmol/L)。每孔100 μl，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h貼壁，棄去培養(yǎng)液。正常組不做處理，僅加入DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)44 h，IL-1β誘導(dǎo)組加入含IL-1β的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)44 h，各給藥組加入含IL-1β和不同濃度AZ的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)44 h，每孔細胞均加入 10 μl MTT(5 g/L)繼續(xù)孵育4 h后，再加入150 μl DMSO溶解細胞內(nèi)結(jié)晶，室溫振蕩溶解，用酶標儀在570 nm測定吸光度值(即A570值)。

1.5Hoechst33258染色觀察細胞凋亡將關(guān)節(jié)軟骨細胞以2×108/L的細胞密度接種于6孔板(孔內(nèi)預(yù)置無菌爬片)，分為正常組、IL-1β誘導(dǎo)組和3組AZ給藥組(12.5、25、50 μmol/L)，每孔2 ml細胞懸液，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，IL-1β組加入含IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，各給藥組加入含10 mg/L IL-1β和不同濃度AZ的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX通透，滴加Hoechst 33258染液(10 mg/L)避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后，吸取上清液至離心管，貼壁細胞用胰酶消化后將細胞轉(zhuǎn)入對應(yīng)離心管，離心，收集細胞，PBS洗滌，加入400 μl Annexin V結(jié)合液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液4 ℃孵育5 min，流式細胞儀檢測，采用WinMDI軟件進行分析。

1.7Rhodamine-123染色觀察細胞凋亡按前述方法進行細胞爬片和藥物處理，PBS洗滌，加入含Rhodamine-123(終濃度10 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。選取5個不同的視野，用ImageJ圖片分析軟件對各視野平均熒光強度進行分析統(tǒng)計。

1.8Westernblot檢測相關(guān)蛋白① 各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后，加入400 μl含磷酸酶抑制劑及PMSF的裂解液，在冰上振動裂解約20～30 min；② 裂解結(jié)束后，利用刮棒將細胞刮至一側(cè)，將細胞碎片移至1.5 ml離心管中，先渦旋10次再12 000 r/min離心取上清液于新的EP管中；③ 取適量上清液加入蛋白上樣緩沖液(4 ∶1)，搖勻，100 ℃煮沸10 min，冷卻待用；④ SDS-PAGE電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，配置5%脫脂牛奶封閉3 h，加入一抗孵育過夜(4 ℃)，二抗孵育1 h；⑤ 使用ECL發(fā)光試劑盒在顯影儀中顯影，采用ImageJ圖片分析軟件對蛋白條帶灰度值進行分析處理。

2　結(jié)果

2.1軟骨細胞的鑒定主要通過觀察細胞形態(tài)變化、蛋白多糖及Ⅱ型膠原的表達，進行關(guān)節(jié)軟骨細胞的鑒定。如圖1A所示，傳1代的細胞形態(tài)以梭形為主，細胞質(zhì)豐富，細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色鑒定顯示：軟骨細胞胞質(zhì)被染成棕色，密集生長處染色較深，表明Ⅱ型膠原存在表達(圖1B)。甲苯胺藍染色結(jié)果顯示：細胞質(zhì)被染成淺藍色，胞核被染成深藍色，有時可見雙核，表明存在蛋白多糖的表達(圖1C)。上述實驗結(jié)果表明培養(yǎng)的細胞與關(guān)節(jié)軟骨細胞特征一致。

圖1　大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的培養(yǎng)和鑒定　×200

2.2AZ對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖的影響MTT法檢測AZ體外對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的影響。如圖2所示，IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞的增殖反應(yīng)明顯低于正常組(F=14.03，P<0.01)，與IL-1β誘導(dǎo)組相比，AZ(12.5、25、50、100 μmol/L)體外給藥能不同程度地提高IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖反應(yīng)，其中25、50和100 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮到50 μmol/L AZ的作用優(yōu)于100 μmol/L，且AZ在12.5～50 μmol /L表現(xiàn)出劑量依賴性(r=0.731，P<0.01)，因此選擇12.5、25和50 μmol/L 3個AZ濃度進行下一步研究。

2.3Hoechst33258染色觀察AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡Hoechst 33258作為一種特異性DNA染料，通過其染色熒光強度能反應(yīng)細胞凋亡情況。如圖3所示，正常組軟骨細胞的細胞核多數(shù)呈現(xiàn)均勻的藍色熒光；IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞可見較多的染色質(zhì)固縮、聚集和核碎裂，呈現(xiàn)出典型凋亡形態(tài)學(xué)改變，表明IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞存在異常凋亡過程；AZ體外給藥組僅有少量的軟骨細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，提示AZ對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞具有抗凋亡作用。

2.4AnnexinV-FITC/PI雙染檢測AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡如圖4所示，在雙變量散點圖上，F(xiàn)ITC-/PI+(左上象限)表示死細胞，F(xiàn)ITC+/PI+(右上象限)表示中晚期凋亡細胞，F(xiàn)ITC-/PI-(左下象限)表示活細胞，F(xiàn)ITC+/PI-(右下象限)表示早期凋亡細胞，右上和右下象限的細胞占全部細胞的比例代表細胞凋亡率(%)，定量分析結(jié)果表明，與正常組(9.20±0.94)%相比，IL-1β誘導(dǎo)組關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡率(33.18±3.06)%明顯增高(F=34.19，P<0.01)，AZ(12.5、25、50 μmol/L)能劑量依賴性地降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡率(r=-0.855，P<0.01)，其中AZ(25、50 μmol/L)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2　AZ對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的影響

1：正常組；2：IL-1β誘導(dǎo)組；3：AZ 12.5 μmol/L；4：AZ 25 μmol/L；5：AZ 50 μmol/L；6：AZ 100 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導(dǎo)組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3　Hoechst 33258 染色觀察AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡　×100

圖4　Annexin-V FITC/PI 雙染檢測AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡

A：正常組；B：IL-1β誘導(dǎo)組；C：AZ 12.5 μmol/L；D：AZ 25 μmol/L；E：AZ 50 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導(dǎo)組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5Rhodamine-123染色檢測AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡線粒體能夠在細胞凋亡過程中起樞紐作用，其膜電位的下降是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中最早期事件。Rhodamine-123作為親脂性陽離子熒光染料在結(jié)合到線粒體基質(zhì)后，其熒光的變化說明線粒體內(nèi)膜電負性的相應(yīng)改變。如圖5所示，正常組軟骨細胞線粒體染色分布均勻，熒光強度強；IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞線粒體對Rhodamine-123的攝取能力降低，熒光強度弱；半定量分析結(jié)果表明，與IL-1β誘導(dǎo)組相比，不同劑量AZ處理組軟骨細胞的熒光強度有不同程度的提高(F=37.41，P<0.01)，其中AZ(25、50 μmol/L)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6AZ對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中AQP1和凋亡相關(guān)基因蛋白表達的影響Western blot法檢測AQP1、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白表達并進行統(tǒng)計學(xué)分析(圖6)。IL-1β組軟骨細胞中AQP1蛋白表達增高，AZ體外給藥可以抑制AQP1蛋白表達(F=11.99，P<0.01)；同時，與正常組比較，IL-1β組的Bcl-2蛋白表達顯著下降(F=30.10，P<0.01)，而Bax和Caspase3 蛋白表達明顯升高(F=50.13、167.88，P<0.01)，與IL-1β組比較，AZ體外能夠提高Bcl-2蛋白表達，并且降低Bax和Caspase3蛋白表達，這可能與AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡的作用密切相關(guān)。

2.7AZ對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中NF-κB信號通路的影響Western blot法檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達并進行統(tǒng)計學(xué)分析(圖7)。與正常組比較，IL-1β組IκB蛋白表達下降(F=172.03，P<0.01)，而p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達增加(F=56.19、61.84，P<0.01)，與IL-1β組比較，AZ體外可以有效抑制IκBα的降解和磷酸化，并顯著減少p-NF-κB p65蛋白表達，而各組細胞中NF-κB p65的蛋白表達水平無明顯改變(F=0.49，P>0.01)，表明AZ體外給藥降低IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡可能通過抑制NF-κB信號通路的活化實現(xiàn)。

圖5　Rhodamine-123染色檢測AZ抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡　×100

圖6　AZ對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中AQP1和凋亡相關(guān)基因蛋白表達的影響

A：各組細胞中AQP1、Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白表達的典型條帶圖；B：蛋白表達的半定量分析統(tǒng)計圖；1：正常組；2：IL-1β誘導(dǎo)組；3：AZ 12.5 μmol/L；4：AZ 25 μmol/L；5：AZ 50 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導(dǎo)組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖7　AZ對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中NF-κB信號通路的影響

A：各組細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達典型條帶圖；B：蛋白表達的半定量分析統(tǒng)計圖；1：正常組；2：IL-1β誘導(dǎo)組；3：AZ 12.5 μmol/L；4：AZ 25 μmol/L；5：AZ 50 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導(dǎo)組比較：*P<0.05，**P<0.01

3　討論

軟骨細胞作為關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細胞類型，維持軟骨組織乃至關(guān)節(jié)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。RA患者關(guān)節(jié)軟骨細胞存在過度凋亡，引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨ECM迅速而廣泛的損失，抑制軟骨細胞凋亡有望成為RA治療的新方法[7-9]。在RA患者滑液和血清中IL-1β是最重要的促炎細胞因子，其通過參與抑制Ⅱ型膠原、蛋白多糖的合成以及誘導(dǎo)軟骨細胞的凋亡、刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生從而導(dǎo)致軟骨ECM降解誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨損傷?，F(xiàn)今，IL-1β誘導(dǎo)建立關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡模型已被廣泛應(yīng)用[6,10]。所以本研究以IL-1β誘導(dǎo)分離培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞使其凋亡，觀察AZ體外對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的影響，并探討其可能機制。

大量研究表明，碳酸苷酶抑制劑AZ可以顯著降低AQP1介導(dǎo)的水通透性[11]，并能夠直接抑制AQP1的表達進而發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的能力[12]，故AZ可以作為合適的AQP1抑制劑，與既往報道一致；本研究顯示AZ體外給藥能夠有效抑制IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞中AQP1蛋白表達。參考既往文獻中AZ的體外給藥劑量，本研究采用MTT法觀察了AZ(12.5、25、50、100 μmol/L)對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖的影響，結(jié)果顯示AZ在12.5～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性地提高IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖反應(yīng)。Hoechst 33258染色結(jié)果表明，IL-1β組軟骨細胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變?nèi)缛旧|(zhì)固縮和核碎裂，而AZ組多數(shù)細胞呈現(xiàn)均勻藍色熒光，凋亡細胞數(shù)相對減少。Annexin-V FITC/PI雙染法結(jié)果表明，與正常組相比，IL-1β誘導(dǎo)組的細胞凋亡率顯著增高，AZ體外給藥可以劑量依賴性地降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡率。Rhodamine-123染色結(jié)果表明，IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞的熒光強度弱，不同劑量AZ處理組軟骨細胞的熒光強度有不同程度的提高。上述結(jié)果提示IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞存在明顯的細胞凋亡過程，AZ體外能夠有效抑制其過度凋亡。

細胞凋亡是一種為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細胞自主性死亡，多種癌基因和抑癌基因都參與了對凋亡的調(diào)控。Bcl-2基因家族中的Bcl-2和Bax是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，Bax介導(dǎo)線粒體細胞色素C的釋放促進細胞凋亡，而Bcl-2與促凋亡蛋白形成異源二聚物抑制細胞凋亡[13]。作為級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase3調(diào)控各條凋亡通路，是凋亡的最終執(zhí)行者，抑制Caspase3活性或功能可減少細胞凋亡[14]。文獻[7,15]報道指出RA軟骨組織中Bcl-2蛋白表達降低，Caspase3蛋白表達升高，與RA關(guān)節(jié)軟骨細胞的異常凋亡過程密切相關(guān)。在本研究中，IL-1β誘導(dǎo)組中Bcl-2(抗凋亡基因)蛋白表達顯著下調(diào)，而Bax和Caspase3(促凋亡基因)蛋白表達明顯升高，AZ體外可以上調(diào)Bcl-2表達、下調(diào)Bax和Caspase3表達，表明AZ能夠通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達進而發(fā)揮其抗凋亡作用。

NF-κB信號通路異?；罨赗A的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，參與RA滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨損傷[16]。在靜息狀態(tài)時，胞質(zhì)中的NF-κB p65與IκB結(jié)合形成無活性的二聚體；在應(yīng)激狀態(tài)時，IκB磷酸化并迅速降解，NF-κB p65與IκB分離，活化的NF-κB p65進入細胞核，導(dǎo)致眾多促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。與既往文獻[10]報道一致，IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細胞存在NF-κB信號通路的過度活化，表現(xiàn)為IκB蛋白表達下降，而p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達增加。余涵 等[17]報道AZ體內(nèi)給藥可以抑制慢性癲癇大鼠海馬組織中NF-κB信號通路的活化，與之相似，在本研究中，AZ體外給藥可以提高IκB蛋白的表達水平，降低p-IκBα和p-NF-κB p65的蛋白表達水平，提示AZ可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞NF-κB信號通路活化，可能與其抗凋亡作用密切相關(guān)。