魏敏

摘要：通過對(duì)一株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）自然突變體cry1C基因的克隆和測(cè)序，分析突變位點(diǎn)對(duì)該基因所表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響及活性喪失的原因。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）；突變體；活性

中圖分類號(hào)：S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）08-0069-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.018

Study on the Loss of Natural Mutant of A Bacillus thuringiensis

WEI Min

（Henan Nursing Vocational College，Anyang 455000，Henan，China）

Abstract： The cry1C gene of a mutant Bacillus thuringiensis natural mutant were cloned and sequenced， and the effects of mutant sites on the protein structure expressed were analyzed by this gene and the causes of loss of activity.

Key words： Bacillus thuringiensis； mutant； activity

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）簡(jiǎn)稱Bt，其產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等多種重要的農(nóng)林業(yè)害蟲以及線蟲、螨類和原生動(dòng)物具有毒殺作用[1]。菌株G43對(duì)夜蛾科害蟲甜菜夜蛾有較好的活性，推測(cè)其可能含有cry1C類基因[2]，但其基因的具體序列還不清楚。在傳代過程中發(fā)現(xiàn)其殺蟲活性完全喪失，把突變體命名為G39，分析可能是其表達(dá)殺蟲晶體蛋白的cry基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致其不能正確地表達(dá)殺蟲晶體蛋白，造成殺蟲活性喪失，為明確該基因發(fā)生突變的位點(diǎn)，對(duì)該菌株中的cry1C基因及其突變體G39菌株中的基因進(jìn)行克隆并測(cè)序[3，4]，分析其突變位點(diǎn)對(duì)該基因表達(dá)蛋白構(gòu)象的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用Bt菌株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組保存；JM109購(gòu)自Novagen；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

液體LB：Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，120 ℃ 20 min。

酶類：限制性內(nèi)切酶及連接酶、高保真KOD plus DNA聚合酶、Rnase購(gòu)自GiBcol、TaKaRa公司。dNTP、Taq酶等購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。DNA回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

Bt總DNA提取液：溶液I，0.3%蔗糖，25 mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH 8.0），Lysozyme 50 mg/mL；溶液II，0.1 mol/L NaCl，0.1% SDS，0.1 mol/L Tris·Cl（pH 8.0）；溶液III，5 mol/L NaAc，用冰乙酸調(diào)至pH 4.8。

1.2 方法

Bt總DNA提取、PCR擴(kuò)增、基因克隆、質(zhì)粒提取均為常規(guī)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的克隆

以菌株G43和G39的總DNA為模版，用cry1C的鑒定引物[1]5′-GTTTAGTGTTGGACGCAATTT-3′和5′-CCAGCGCCACCATTTAA-3′擴(kuò)增檢測(cè)出菌株G43和G39中確實(shí)含有cry1C類基因（圖1）。

用全長(zhǎng)引物5′-ATGGAGAATAATATTCAAAAT CAATGC-3′和5′-GGAATTACTCCTTATGGAGGAAT AA-3′和KOD plus DNA聚合酶擴(kuò)增得到全長(zhǎng)3.5 kb cry1C的全長(zhǎng)DNA（圖2）。

將產(chǎn)物回收、純化，利用Taq DNA聚合酶延伸加“A”尾。最終PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后插入pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖3）。

2.2 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的序列測(cè)定及分析

對(duì)經(jīng)過PCR和酶切鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，分別測(cè)得菌株G43和G39的全長(zhǎng)DNA序列。菌株G43的序列通過NCBI BLAST比對(duì)，與cry1Ca9的相似性最高，為99%，全長(zhǎng)3 570 bp，1 189個(gè)氨基酸，各種氨基酸的個(gè)數(shù)及占比見表1。由表1可知，谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）和天冬酰胺（Asn）含量最高，分別為8.07%、7.23%、8.66%和7.15%，該Cry1Ca蛋白分子量為134.48 kD，等電點(diǎn)為pH 4.745，是弱酸性蛋白質(zhì)?？寺ry1C基因?yàn)闃?gòu)建對(duì)甜菜夜蛾等害蟲有高活性的工程菌株創(chuàng)造了條件。

2.3 菌株G39中cry1C基因的突變分析

測(cè)序發(fā)現(xiàn)，突變體和原始菌株的蛋白序列主要在N端發(fā)生了一些變化，由測(cè)序得到的G39和G43的cry1C基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)如下。

比較發(fā)現(xiàn)，突變體的氨基酸序列共發(fā)生了8個(gè)位點(diǎn)的突變。第1至第5位由MEENN突變?yōu)?GGKY，第751位由I突變?yōu)閂，第1 063位由D突變?yōu)镚，第1 073位由E突變?yōu)镚。圖4顯示了Cry1Ca蛋白的活性區(qū)的3個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括35-625位氨基酸。突變的位點(diǎn)雖然不在該蛋白的活性區(qū)域內(nèi)，但是由于起始密碼子的缺失，直接導(dǎo)致了該基因編碼的Cry1Ca蛋白不能表達(dá)。

3 小結(jié)與討論

本研究在分子水平上驗(yàn)證了菌株在傳代過程中確實(shí)會(huì)出現(xiàn)自然突變體，也為尋找更好的殺蟲活性蛋白提供了思路和資源。然而由于自然突變的不確定性，基因突變往往導(dǎo)致殺蟲蛋白活性的降低或喪失。本研究通過研究自然突變體活性喪失的原因，進(jìn)一步明確殺蟲蛋白結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系[5]，為人工改造殺蟲基因，提高殺蟲活性提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 曾曉慧，張宏宇，喻子牛，等.蘇云金芽孢桿菌對(duì)甜菜夜蛾幼蟲毒力的生物測(cè)定方法[J].中國(guó)生物防治，1998，14（4）：172-175.

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[5] 魏 敏.殺蚊蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].安陽(yáng)工學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，10（6）：19-21.