陳 浩,覃小麗,夏 濤,李月婷,鞏仔鵬,李勇軍,3,鄭 林

(貴州醫(yī)科大學(xué)1. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心、3. 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

葒草花為蓼科葒草PolygonumorientaleL.的干燥花序，又名狗尾巴花、水葒花、何草花等，以其全株收載于2003版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[1]，具有行氣消積、活血、止痛的功效，用于腹中痞積、頭痛、心胃氣痛等疾病的治療[2]。課題組前期對(duì)葒草各部位藥理篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，葒草花比其“全草”具有更為明顯的抗心肌缺血作用，為葒草的主要藥效部位[3]。目前，已從葒草花活性部位中提取并鑒定了槲皮素、山奈酚、槲皮苷、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷5種成分[4]。在對(duì)葒草花進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，如槲皮苷、山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷的絕對(duì)生物利用度低[5]，限制其口服給藥后藥效的發(fā)揮。而關(guān)于葒草花提取物吸收特性尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究其口服吸收機(jī)制及影響因素，為葒草花提取物的口服制劑研發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要意義。在口服藥物吸收特性的體外研究中，人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(Caco-2細(xì)胞系)已成為經(jīng)典的細(xì)胞模型，具有類似于腸上皮細(xì)胞的特征，在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面與腸上皮細(xì)胞具有相似性。該模型重現(xiàn)性好，與腸道的吸收機(jī)制具有良好的相關(guān)性，常作為藥物腸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特征研究的體外模型[6-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用Caco-2細(xì)胞模型作為一種中藥吸收研究的篩選工具，并采用UPLC-MS/MS建立葒草花提取物中5個(gè)成分的分析方法，測(cè)定葒草花提取物在時(shí)間、濃度、溫度、pH和P-gp抑制劑條件下對(duì)Caco-2細(xì)胞的吸收攝取影響，以闡明葒草花5種提取物的吸收機(jī)制，為初步評(píng)價(jià)葒草花提取物的體內(nèi)吸收特性和葒草花提取物的口服制劑研發(fā)及臨床應(yīng)用奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)150702)、山奈酚對(duì)照品(批號(hào)150328)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào)151222)，均購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；葒草花有效組分(自制，批號(hào) 20150915)；葒草花藥材購(gòu)自貴州貴陽(yáng)鹿沖關(guān)貴州省藥用植物園種植基地，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定；葛根素 (批號(hào)110752-201514)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷對(duì)照品(自制)。Caco-2(American Type Culture Collection)，30～50代；DMEM、FBS、Trypsin-EDTA均購(gòu)于Thermo Fisher Scientific；RIPA、鼠尾I型膠原蛋白均購(gòu)于Aladdin Industrial Corporation；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒均購(gòu)于南京建成科技有限公司；BCA蛋白測(cè)試試劑盒(Solarbio)；熒光素鈉(上海靈錦精細(xì)化工有限公司)；MTS(Promega)；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2儀器Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(Beckman Coulter)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；TS-100F倒置顯微鏡和CCD照相機(jī)(Nikon)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備總廠)；Millicell培養(yǎng)皿和Millicell?-ERS Ⅱ電阻儀(Millipore)。

1.3色譜條件Acquity? Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 色譜柱； 0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～1.0 min：5%～15%，1.0～3.8 min：15%～18%，3.8～4.0 min：18%～90%，4.0～5.0 min，90%～5%[9]進(jìn)樣體積：2 μL；柱溫：45℃。

1.4質(zhì)譜條件Waters Acquity TQD 質(zhì)譜儀；毛細(xì)管電離電壓：3 kV；電噴霧離子源(ESI)；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)；離子源溫度：120℃；去溶劑N2溫度：350℃，流速650 L·h-1；反吹氣N2流速：50 L·h-1；碰撞氣Ar流速：0.16 mL·min-1，數(shù)據(jù)分析：MassLynx V4.1工作站。離子對(duì)如下：山奈酚m/z(+)287.1→213.2、槲皮素m/z(+)303.2→153.1、槲皮苷m/z(+)449.1→303.2、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷m/z(+)449.05→287.2、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷m/z(+)433.1→287.2，葛根素(內(nèi)標(biāo))m/z(-)417.0→267.0；錐孔電壓分別為：45 V、45 V、20 V、25 V、20 V、40 V；碰撞電壓分別為：30 V、40 V、10 V、10 V、10 V、30 V。

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備分別精密稱取槲皮素等5種樣品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL。得槲皮素(1.22 g·L-1)、山奈酚(1.13 g·L-1)、槲皮苷(1.1 g·L-1)、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷 (1.1 g·L-1)、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷(0.96 g·L-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取槲皮素等5種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，37℃氮?dú)獯蹈桑刺荻认♂尦伤铦舛?，得混合系列?biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱維拉帕米和環(huán)孢菌素A適量，HBSS定容至10 mL，得維拉帕米 (10 g·L-1)，環(huán)孢菌素A (5 g·L-1)溶液，置溫度為-20℃冰箱中保存，備用。

1.6細(xì)胞裂解液的制備將已培養(yǎng)好的Caco-2用預(yù)熱的HBSS液輕輕清洗細(xì)胞表面。然后將提取物按設(shè)定的組別溶解于HBSS，每孔添加1.5 mL，培養(yǎng)90 min，取出后，添加4℃的HBSS終止攝取，并用HBSS迅速?zèng)_洗3遍，加入500 μL RIPA，4℃條件下振蕩，裂解細(xì)胞，取出，超聲5 min，混勻，轉(zhuǎn)移，得細(xì)胞混懸液[10]。

1.7樣品前處理取400 μL細(xì)胞裂解液和細(xì)胞混懸液，再取50 μL內(nèi)標(biāo)溶液和2 mL乙酸乙酯加入，渦混3 min，6 000 r·min-1離心，提取上清液2 μL進(jìn)LC-MS分析。

1.8Caco-2細(xì)胞模型的建立將Caco-2細(xì)胞株迅速?gòu)?fù)蘇，接種于T-25斜頸培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、1%雙抗。置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱(相對(duì)濕度90%)培養(yǎng)。待培養(yǎng)的細(xì)胞90%融合時(shí)，用PBS洗凈細(xì)胞表面雜質(zhì)，再用37℃預(yù)熱的胰酶-EDTA消化后，接種于6孔培養(yǎng)板， 24 h后更換培養(yǎng)液，以后隔日換液，1周后每天換液，培養(yǎng)14 d后，待細(xì)胞生長(zhǎng)均勻、邊界清晰，成單層膜狀態(tài)，測(cè)定細(xì)胞跨膜電阻值為300 Ω·cm2以上[9-10]，可用于測(cè)定的葒草花提取物中各化合物在Caco-2細(xì)胞中的攝取特點(diǎn)。

1.9Caco-2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

1.9.1不同濃度葒草花提取物對(duì)細(xì)胞的毒性 將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和藥物組，空白對(duì)照組添加100 μL的無(wú)血清DMEM；藥物組用無(wú)血清DMEM將受試化合物配制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 g·L-1的稀釋液，每孔添加100 μL藥液，置于95% O2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度平行5孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？疾觳煌瑵舛热嚥莼ㄌ崛∥飳?duì)細(xì)胞的毒性。

1.9.2濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 取不同濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g·L-1)的葒草花提取物的HBSS溶液2 mL(n=3)，置于Caco-2細(xì)胞中，在37℃下培養(yǎng)1 h，考察不同葒草花提取物濃度對(duì)細(xì)胞攝取的影響。

1.9.3時(shí)間依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 將2 g·L-1葒草花提取物加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞中，考察在不同攝取時(shí)間(30、60、90、120、180 min)條件下，葒草花提取物被Caco-2細(xì)胞攝取的變化。

1.9.4不同pH對(duì)葒草花提取物攝取的影響 將2 g·L-1葒草花提取物分別溶于不同pH(5.0、6.0、7.4)的HBSS緩沖液中，測(cè)定在加藥90 min后不同pH值條件下，Caco-2細(xì)胞攝取的變化。

1.9.5不同溫度對(duì)葒草花提取物攝取的影響 將2 g·L-1葒草花提取物溶于HBSS緩沖液中，于不同溫度(4℃、25℃、37℃)條件下培養(yǎng)，在加藥90 min后，分別測(cè)定在不同溫度條件下，Caco-2細(xì)胞攝取的變化。

1.9.6P-gp對(duì)葒草花提取物攝取的影響 分別加入含環(huán)孢菌素A (10 mg·L-1)的葒草花提取物(2 g·L-1)溶液，維拉帕米 (50 mg·L-1)的葒草花提取物(2 g·L-1)溶液，分別于給藥90 min后，測(cè)定有無(wú)抑制劑時(shí)，Caco-2細(xì)胞對(duì)葒草花提取物攝取的影響。

2 結(jié)果

2.1UPLCMS/MS分析方法的確證分別取空白細(xì)胞混懸液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)為葛根素)以及進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞樣品溶液，渦旋2 min，15 000 r·min-1離心10 min，分離上清液進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)表明，空白細(xì)胞混懸液中無(wú)雜質(zhì)峰干擾，細(xì)胞混懸液中槲皮素等5種成分及內(nèi)標(biāo)葛根素分離完全，保留時(shí)間(Rt)分別為1.35、3.82、3.98、2.30、2.27、2.91 min。結(jié)果見(jiàn)Fig 1，圖中以時(shí)間為橫坐標(biāo)，百分強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。

以樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比和混合溶液中的藥物濃度分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，得到葒草花5種成分的工作曲線，其線性范圍、回歸方程如Tab 1所示。槲皮素等5種成分?jǐn)z取轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別見(jiàn)Tab 1。各成分在0.05～72 mg·L-1范圍線性關(guān)系良好 (r≥0.999 )。

根據(jù)“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)，分別配制高，中，低3個(gè)濃度的山奈酚等5種成分的溶液作為質(zhì)量控制樣品，在所確定的質(zhì)譜條件下分析，將測(cè)定的濃度與加入已知標(biāo)液濃度濃度比較，求得回收率均大于90%，每個(gè)濃度再分別配制5份進(jìn)行樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，日內(nèi)精密度RSD%為1.12%～4.74%，日間精密度RSD%為1.14%～4.53%。

將上述質(zhì)控樣品，放置于室溫，分別于1、2、3 d后取樣處理分析，根據(jù)槲皮素等5種成分的色譜峰面積計(jì)算其RSD%，結(jié)果槲皮素等5種成分與零時(shí)比較，RSD值均小于3%。上述結(jié)果表明，此方法穩(wěn)定、靈敏，重現(xiàn)性好。

2.2Caco-2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

2.2.1不同濃度葒草花提取物對(duì)細(xì)胞的毒性 如Fig 2所示，各給藥組在所設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，葒草花提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒性作用，可以進(jìn)行下一步攝取實(shí)驗(yàn)。

Tab 1 The mean values of regression equation of the analytes

Fig 1 UPLC-MS/MS chromatogram of all compounds in uptake test

A: Blank solution; B: Blank solution spiked with standands; C: Real sample. 1: Puerarin; 2: Quercetin; 3: Kaempferol; 4: Quercetin-3-rhamnoside; 5: Kaempferide-3-O-β-D-lglucoside; 6: Kaempferide-3-O-α-L-rhamnoside

Tab 2 Effect of different pH of compounds on Caco-2 cell

*P<0.05,**P<0.01vspH=6

Fig 2 Effect of Polygonum orientale L. Flower extracton cytotoxicity of Caco-2 cells(n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2.2濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 如Fig 3所示，槲皮素等5個(gè)成分的攝取量隨濃度的增加而增加，表明葒草花中5個(gè)成分的攝取方式主要表現(xiàn)為被動(dòng)擴(kuò)散。

Fig 3 Effect of different concentrations of Polygonum orientale L.

2.2.3時(shí)間依賴性攝取實(shí)驗(yàn) Fig 4結(jié)果表明，槲皮素等5個(gè)成分的攝取量隨時(shí)間的增加而降低，可能原因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，各成分之間的吸收可能相互影響，也可能由于酶的水解和轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響，導(dǎo)致槲皮素等5個(gè)成分的攝取量隨時(shí)間的增加而降低。綜合考慮，選擇90 min作為最佳攝取時(shí)間來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 4 Effect of different time of Polygonum orientale L.

2.2.4不同pH對(duì)葒草花提取物攝取的影響 Tab 2結(jié)果表明，槲皮素等5個(gè)成分在pH 7.4和pH 5時(shí)吸收特性與pH 6時(shí)差異有顯著性。除槲皮素外，其余4種成分在pH 6.0時(shí)，吸收大于pH 7.4和pH 5，差異具有顯著性；槲皮素在pH 5時(shí)，吸收明顯大于pH 6.0，可能原因?yàn)槠浔旧頌槿跛嵝曰衔?，在酸性條件下更易被吸收。

2.2.5不同溫度對(duì)葒草花提取物攝取的影響 Fig 5結(jié)果表明，槲皮素等5種成分在37℃的條件下，攝取量均大于4℃和25℃，并且攝取量隨溫度的增加而增加。

2.2.6P-gp對(duì)葒草花提取物攝取的影響 在以上實(shí)驗(yàn)所確定的pH為6，溫度為37℃的攝取條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，Tab 3結(jié)果表明，在合并維拉帕米或環(huán)孢菌素A條件下，葒草花中槲皮素和山奈酚攝取量明顯增加，表明槲皮素和山奈酚可能是P-gp的底物。

Tab 3 Effect of P-glycoprotein inhibitors on compound uptake in Caco-2

*P<0.05,**P<0.01vsPolygonumorientaleL. Flower extract from control group

Fig 5 Effect of different temperature of Polygonum orientale L.

其余各成分的攝取不受抑制劑的影響。

3 討論

Caco-2細(xì)胞模型具有較高的重現(xiàn)性，兼具快速、易于控制、干擾小、可連續(xù)檢測(cè)和接近藥物在人體內(nèi)吸收的實(shí)際環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，成為預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)吸收、闡明藥物吸收機(jī)制的良好工具，被國(guó)內(nèi)外廣泛用于藥物吸收特性研究[11]。

研究表明，在0.2～5.0 g·L-1濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞攝取表現(xiàn)為一級(jí)速率過(guò)程，表明其攝取方式主要為被動(dòng)擴(kuò)散。但攝取量隨時(shí)間的增加而降低，提示藥物在進(jìn)入細(xì)胞后可能受到酶的水解和轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中攝取量隨時(shí)間的增加而降低，在葒草花提取物的5種代表性成分中，除槲皮素和山奈酚外，其余都為苷類化合物，而苷類藥物進(jìn)入細(xì)胞后容易被水解。同時(shí)，由于受到轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排作用，是導(dǎo)致攝取量隨時(shí)間的增加而降低的可能原因。在維拉帕米參與的條件下，槲皮素和山奈酚攝取量明顯增加，也進(jìn)一步證實(shí)槲皮素和山奈酚的吸收受到P-gp的外排作用，降低了藥物的吸收。

同時(shí)，胃腸道內(nèi)的pH環(huán)境影響藥物在體內(nèi)的溶解性和吸收情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH為5時(shí)，槲皮素的攝取明顯增加，這可能與其化合物本身含有酚羥基酸性基團(tuán)有關(guān)。當(dāng)化合物呈酸性時(shí)，在中性和偏堿性的環(huán)境中以電離形式存在，導(dǎo)致其提取物在細(xì)胞膜的滲透性降低。且由于溫度對(duì)酶影響，使其提取物的細(xì)胞攝取量呈溫度依賴性。

本實(shí)驗(yàn)初步闡明了葒草花5種提取物的細(xì)胞吸收機(jī)制及其影響因素，為其臨床應(yīng)用及口服制劑的研究開(kāi)發(fā)提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。但是，目前運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型研究中藥大多是單一的對(duì)中藥化學(xué)成分的研究，而中藥含多種成分，且成分復(fù)雜，只通過(guò)對(duì)單一成分的吸收機(jī)制來(lái)說(shuō)明其中藥的吸收機(jī)制具有片面性，容易忽視成分間的相互影響。所以，運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型對(duì)中藥多成分吸收特征及篩選研究，對(duì)中藥復(fù)雜成分的吸收機(jī)制闡明具有參考意義。

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