， ， ， ，

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037；2.青海省林業(yè)廳種苗站， 西寧 810000)

沼生櫟(Quercuspalustris)為殼斗科櫟屬落葉喬木，廣泛分布于美國(guó)東部地區(qū)，在潮濕地帶也能很好地生長(zhǎng)[1]。沼生櫟樹(shù)形優(yōu)美，葉片寬大，葉緣齒裂，新葉亮嫩紅色，秋天變成橙紅色或銅紅色，是非常美觀的行道樹(shù)，具有很高的園林觀賞價(jià)值[2]。近年來(lái)廣泛引種到我國(guó)很多地區(qū)，是華北地區(qū)向陽(yáng)溫暖地帶河湖濕地的優(yōu)良綠化樹(shù)種。另外，沼生櫟是所有櫟樹(shù)中適生范圍最廣的樹(shù)種之一[3]。

在育苗生產(chǎn)過(guò)程中，沼生櫟多以種子繁殖為主。然而，該種子含水量較高，對(duì)失水較為敏感，這給其運(yùn)輸、貯藏帶來(lái)了諸多不便。本研究采用自然干燥法降低種子的含水量，研究失水過(guò)程中發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及其相應(yīng)生理指標(biāo)的變化，以探究失水對(duì)沼生櫟種子質(zhì)量的影響，為其生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沼生櫟種子于2016年12月上旬購(gòu)于上?，庣鲌@林科技有限公司，種子千粒重為1.834 kg。購(gòu)買(mǎi)種子后立即將其攤開(kāi)置于實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面上自然晾干，每隔7 d取樣1次，用于各指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子含水量測(cè)定

隨機(jī)數(shù)取新購(gòu)(對(duì)照)以及各處理階段沼生櫟種子4粒，重復(fù)3次，將每粒種子切成4份后，用千分之一天平稱(chēng)重，按照GB 2772—1999 《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》[4]的要求，采用低恒溫烘干法測(cè)定種子的含水量。

1.2.2 種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)測(cè)定

隨機(jī)數(shù)取新購(gòu)買(mǎi)的種子和各干燥階段的種子各50粒，重復(fù)3次，置于沙床中，將其放在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。置床后3 d開(kāi)始觀測(cè)記錄種子發(fā)芽數(shù)，以胚根長(zhǎng)出1 cm作為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽的粒數(shù)以及發(fā)芽所需要的時(shí)間。按照GB 2772—1999《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》[4]的規(guī)定，連續(xù)3 d的發(fā)芽粒數(shù)不超過(guò)1%時(shí)即認(rèn)為發(fā)芽結(jié)束。發(fā)芽結(jié)束后，計(jì)算對(duì)照及各處理的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)指標(biāo)。

1.2.3 各處理階段種子生理指標(biāo)測(cè)定

對(duì)各處理階段的種子分別進(jìn)行各生理指標(biāo)測(cè)定：過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[5]；過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定參照王群等[6]的方法；丙二醛(MDA)含量的測(cè)定參照趙世杰等[7]的方法；種子浸出液相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定參照韓建國(guó)等[8]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007軟件收集、處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并制作圖表，SPSS軟件進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼生櫟種子失水過(guò)程中種子質(zhì)量的變化

失水過(guò)程中，沼生櫟種子發(fā)芽率的變化見(jiàn)表1。由表1可知，自然干燥過(guò)程中，種子的失水速度較快，自然晾干21 d時(shí)，含水量由對(duì)照的38.0%下降至9.3%。期間種子的外部形態(tài)也在不斷變化，從種皮開(kāi)始慢慢變硬，到后來(lái)子葉與種皮漸漸分離，晃動(dòng)時(shí)種子內(nèi)部明顯有響聲；失水21 d后，子葉與種皮已完全分離，說(shuō)明不宜在自然條件下采用敞開(kāi)容器存放沼生櫟種子。新鮮沼生櫟種子發(fā)芽率可達(dá)100%，然而在種子含水量下降的過(guò)程中，發(fā)芽率呈快速下降的趨勢(shì)，且失水各階段種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)變化都呈顯著下降趨勢(shì)。當(dāng)放置14 d時(shí)，含水量從38.0%下降至16.0%，這一含水量仍遠(yuǎn)高于大多數(shù)種子的安全含水量，但此時(shí)發(fā)芽率從100.0%下降至52.0%，下降了48.0%，發(fā)芽指數(shù)的下降幅度更大，由對(duì)照的22.6下降到8.6，下降了61.9%。失水21 d，含水量進(jìn)一步下降至9.3%，但此時(shí)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均降為0，種子完全喪失萌發(fā)能力。

表1 失水對(duì)沼生櫟種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的影響

晾干時(shí)間(d)含水量(%)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)(%)038.0±1.0a100.0±0.0a22.6±2.0a727.3±1.53b86.0+2.0b14.0±1.7b1416.0±1.0c52.0±8.7c8.6±0.5c219.3±1.5d0.0±0.0d0.0±0.0d

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；數(shù)據(jù)后的小寫(xiě)字母相同表示結(jié)果在0.05水平差異不顯著，字母不相同表示在0.05水平差異顯著。下同。

2.2 沼生櫟種子失水過(guò)程中各生理指標(biāo)的變化

失水過(guò)程中種子各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化見(jiàn)表2。

表2 沼生櫟種子生理生化指標(biāo)的變化

晾干時(shí)間(d)POD活性U/(g·min)CAT活性U/(g·min)MDA含量(μmol/g)(FW)浸出液相對(duì)電導(dǎo)率(%)0173.0±12.5a175.2±4.2a7.2±1.4a42.1±1.4a7159.0±10.0a156.5±4.2b11.3±1.4b45.3±1.4a14153.6±7.3a152.1±5.6b9.7±4.5a59.6±3.6b2185.3±9.4b138.3±1.4c10.6±3.2b81.3±4.7c

2.2.1 種子失水過(guò)程中過(guò)氧化物酶(POD)活性的變化

POD是清除植物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的保護(hù)酶，起維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與完整性的作用，在有生命力的種子體內(nèi)其活性一般很高[9]。由表2可知，隨著種子晾干時(shí)間的延長(zhǎng)，POD活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但在處理7 d、14 d時(shí)，種子POD活性均差異不顯著。晾干時(shí)間延長(zhǎng)到21 d時(shí)， POD活性由對(duì)照的173.0 U/(g·min)下降到85 U/(g·min)，下降了50.9%，且與上面3個(gè)階段的差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。

2.2.2 種子失水過(guò)程中過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的變化

表2表明，新鮮沼生櫟種子體內(nèi)具有較高的CAT活性，但隨著晾干時(shí)間的延長(zhǎng)，其CAT活性逐漸減弱。晾干時(shí)間到7 d時(shí)，CAT活性由對(duì)照的175 U/(g·min)下降到了156 U/(g·min)，呈顯著水平(p<0.05)。晾干時(shí)間從7 d至14 d這一階段，CAT活性雖有下降的趨勢(shì)，但差異并不顯著。當(dāng)晾干時(shí)間到21 d時(shí)，種子CAT活性進(jìn)一步顯著下降到138 U/(g·min)，較對(duì)照下降了21.1%。

2.2.3 種子失水過(guò)程中丙二醛(MDA)含量的變化

當(dāng)種子質(zhì)量下降時(shí)，脂膜會(huì)發(fā)生過(guò)氧化作用，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的交聯(lián)聚合，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而MDA為脂膜過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量可以反映細(xì)胞膜受損害的程度[10]。由表2可知：MDA含量在種子失水過(guò)程中，總體呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，最終較初始值(對(duì)照)高3μmol/g(FW)。在晾干時(shí)間7，14，21 d時(shí)，MDA含量分別上升了57.1%、28.6%和42.9%，且各階段差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。在種子自然晾干7 d時(shí)，種子體內(nèi)MDA含量最高，至14 d時(shí)，由于種子自身的抗逆性抑制了MDA的合成，在一定的程度上消除了細(xì)胞毒性物質(zhì)的增加，因而MDA含量有一定程度的下降。然而，隨著含水量的進(jìn)一步降低，種子不能夠維持自身的代謝平衡，膜脂過(guò)氧化作用繼續(xù)加劇，最終使種子細(xì)胞膜大幅受損，MDA含量再次大幅增加。

2.2.4 種子浸出液相對(duì)電導(dǎo)率的變化

種子浸出液相對(duì)電導(dǎo)率的變化可以直觀的反映種子失水過(guò)程中細(xì)胞膜完整性的變化情況，從而判斷其膜系統(tǒng)是否受到傷害[11-12]。由表2可知：沼生櫟種子在自然晾干的過(guò)程中，浸出液相對(duì)電導(dǎo)率一直呈上升趨勢(shì)且恒高于水(3%)。在種子晾干至14 d時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率從對(duì)照的42.1%上升至59.6%，顯著高于7 d和對(duì)照的結(jié)果(p<0.05)。當(dāng)晾干時(shí)間延長(zhǎng)至21 d時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率上升至81.3%，較對(duì)照上升了39.2%，且與前3個(gè)階段的差異都達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。這表明在種子晾干時(shí)間延長(zhǎng)至21 d時(shí)，細(xì)胞膜受到傷害的程度進(jìn)一步加大。

總體來(lái)看，自然晾干過(guò)程中，隨著種子含水量的變化，其體內(nèi)相關(guān)酶的活性也較對(duì)照發(fā)生了一定的變化，晾干14 d時(shí)，有的指標(biāo)如CAT、相對(duì)電導(dǎo)率較對(duì)照顯著變化，但有的指標(biāo)如POD較對(duì)照雖有較大幅度的下降，但差異并不顯著。種子自然晾干21 d時(shí)，POD活性直線下降，說(shuō)明此時(shí)種子內(nèi)產(chǎn)生的自由基同保護(hù)酶之間失衡，自由基含量積累過(guò)多，加劇了膜脂的過(guò)氧化程度，對(duì)種子造成了較為嚴(yán)重的傷害，最終導(dǎo)致種子質(zhì)量的下降。

3 討 論

本研究中，隨著晾干時(shí)間的延長(zhǎng)，沼生櫟種子的含水量迅速下降，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至21 d時(shí)，種子含水量由最初的38.0%迅速下降至9.3%(此含水量約為正常種子的安全含水量)。在含水量降低的過(guò)程中，種子質(zhì)量如發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)也顯著下降，且在每個(gè)處理階段的差異均達(dá)到顯著水平(p<0.05)，晾干21 d時(shí)種子已完全喪失發(fā)芽能力(表1)。這些結(jié)果表明：沼生櫟種子對(duì)脫水比較敏感，表現(xiàn)出典型的頑拗性種子的特性。因此沼生櫟種子在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中，要保持種子的含水量處于較高的狀態(tài)，避免因含水量的降低而影響種子質(zhì)量。

種子自然晾干過(guò)程中，種子體內(nèi)也發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化。伴隨著含水量的下降，POD和CAT活性也逐漸下降，使種子體內(nèi)自由基的積累增加，加劇了細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化作用，使細(xì)胞膜的完整性受到破壞，相對(duì)電導(dǎo)率增加(表2)，最終使種子發(fā)生劣變[13-15]，種子質(zhì)量下降。這與顏世超等研究銀杏種子隨著含水量變化過(guò)程中酶的活性變化一致[16]。曾桃等也認(rèn)為：頑拗性種子自然脫水程度越高，其POD活性越低[17]。在種子含水量剛開(kāi)始下降的時(shí)期，種子體內(nèi)的POD和CAT可以起到一定程度的自我修復(fù)作用[18]，因此在種子失水的前14 d，相對(duì)電導(dǎo)率呈緩慢上升的趨勢(shì)，僅由對(duì)照的42.1%上升至59.6%；當(dāng)種子含水量進(jìn)一步下降至9.3%時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率驟然上升(表2)，這可能與此時(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞有關(guān)，此時(shí)電解質(zhì)外滲量持續(xù)增加，細(xì)胞的修復(fù)能力較低或已經(jīng)完全喪失，種子趨向死亡，這與宗梅等[19]的研究結(jié)果相一致。

失水過(guò)程中，種子含水量從38.0%降至9.3%，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈顯著降低的趨勢(shì)。當(dāng)晾干至14 d時(shí)，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)比對(duì)照分別下降了48.0%、61.9%，此過(guò)程中，種子體內(nèi)的生理指標(biāo)雖然也發(fā)生了一定的變化，但變化幅度較發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)要小，如種子晾干至14 d時(shí)，POD活性?xún)H較對(duì)照下降了11.2%，且差異不顯著；CAT活性雖較對(duì)照顯著下降，但僅下降了13.1%；浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度較大，為40.5%，但也沒(méi)有發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的變化幅度大。對(duì)于一般種子而言，種子在失水過(guò)程中，其發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)的變化幅度往往低于種子生理生化指標(biāo)的變化幅度，這與本研究結(jié)果并不一致，可能與沼生櫟種子的頑拗性有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

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