張遵霞 張亞妮 方偉 張志剛 王開梅 萬(wàn)中義

摘要：從中國(guó)四川樂山地區(qū)采集的土樣中分離到1株放線菌HBERC-21542，農(nóng)藥活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵粗提物對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲具有很好的殺蟲活性。對(duì)HPLC半制備組分進(jìn)行農(nóng)藥活性測(cè)定結(jié)果表明，其殺蟲活性成分出峰時(shí)間在14～19 min。根據(jù)HPLC-MS圖譜特征確定了活性物質(zhì)的分子離子峰及分子量，結(jié)合UV吸收光譜及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步確定其為聚醚化合物費(fèi)棱西霉素A。對(duì)發(fā)酵提取物進(jìn)行HPLC制備后，獲得了純度在90%左右的純品，在50 μg/mL濃度下，其對(duì)小菜蛾、棉鈴蟲的殺蟲效果達(dá)到90%～100%。

關(guān)鍵詞：天然產(chǎn)物；殺蟲活性；放線菌；費(fèi)棱西霉素A

中圖分類號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）07-0061-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.07.014

Identification and Evaluation of a Natural Product with Insectcidal Activity Produced by an Actinomycetes Strain

ZHANG ZUN-xia， ZHANG Ya-ni， FANG Wei， ZHANG Zhi-gang， WANG Kai-mei， WAN Zhong-yi

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesticide， Hubei Agricultural Sciences and Technology Innovation Center， Wuhan 430064， China）

Abstract： During the screening process of natural products produced by actionmycetes，a strain HBERC-21542 was isolated from soil samples collected in Leshan district，Sichuan province. The fermentation extract exhibited strong insectcidal activities against some insects such as Plutella xylostell，Helicoverpa armigera，etc. It was determined by components bioassay that the active compounds were in between 14～19 min in HPLC profile，and the active compound was identified as Ferensimycin A based on MS，UV absoption spectrum and natural product dictionary. Pure compound of 90% was obtained by preparative HPLC，and the lethal rate was 90%～100% at 50 μg/mL against Plutella xylostell，Helicoverpa armigera.

Key words： natural products；insectcidal activity；actinomycetes；Ferensimycin A

在生物源農(nóng)藥的研究及開發(fā)工作中，放線菌產(chǎn)生的活性天然產(chǎn)物是其重要來(lái)源。在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上，農(nóng)用抗生素占生物源農(nóng)藥市場(chǎng)份額的90%左右[1]。天然產(chǎn)物的重要性在于，一方面，它們可經(jīng)過發(fā)酵、提取及劑型化等后處理過程制成生物農(nóng)藥，如現(xiàn)在廣泛使用的生物農(nóng)藥阿維菌素、多殺菌素、井岡霉素、農(nóng)抗120等[2]；另一方面，以天然產(chǎn)物為模板，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化改造，是研發(fā)高效、低毒、綠色農(nóng)藥的另一途徑，如阿米西達(dá)，就是以真菌產(chǎn)生的Strobilurin[3]為先導(dǎo)化合物經(jīng)人工改造而獲得的。

HBERC-21542是湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心在農(nóng)藥活性天然產(chǎn)物篩選過程中，從四川樂山地區(qū)采集的土樣中分離到的1株放線菌，其發(fā)酵提取物經(jīng)室內(nèi)生物測(cè)定，對(duì)多種農(nóng)作物害蟲靶標(biāo)具有良好的殺蟲活性，對(duì)發(fā)酵提取物進(jìn)行HPLC半制備及自動(dòng)收集，獲得了不同時(shí)間流出的樣品共36份，經(jīng)生物測(cè)定，確定其活性成分在14～19 min。對(duì)提取物的HPLC-MS圖譜分析后，確定了目標(biāo)產(chǎn)物的紫外吸收波長(zhǎng)及分子量，結(jié)合天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，初步鑒定出活性產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并采用純品進(jìn)行了室內(nèi)活性評(píng)價(jià)，以期為生物源農(nóng)藥的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 放線菌HBERC-21542，分離自四川樂山地區(qū)采集的山地渣土，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離保藏。

農(nóng)藥活性測(cè)定用蟲：小菜蛾（Plutella xylostell）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、蚜蟲（Aphis craccivora）。農(nóng)藥活性測(cè)定用草：浮萍（Lemna minor）、油菜（Brassica campestris）、狗芽根[Cynodon dactylon（Lynn.）]。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基：ISP-2培養(yǎng)基。采用18 mm×180 mm玻璃試管，每管裝瓊脂培養(yǎng)基8～10 mL。

2）種子培養(yǎng)基：同ISP-2，不加瓊脂，另加入2～4滴豆油作消泡劑。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：主要成分為葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉等。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要設(shè)備及軟件、數(shù)據(jù)庫(kù) LYO-0.8型冰凍干燥機(jī)（上海東富龍科技有限公司生產(chǎn)）；Büchi Evaprator R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Waters高效制備液相色譜儀（Waters 2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，2996二極管陣列式檢測(cè)器）、Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二極管陣列式檢測(cè)器）、Micromass Quattro micro ？誖質(zhì)譜儀（電噴霧離子源ESI、正負(fù)離子模式）；Masslynx V 4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件，查普曼（Chapman）天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)2003版。

1.1.4 主要化學(xué)試劑 乙腈、甲醇、乙酸，色譜純（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（西隴化工股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵 在嚴(yán)格無(wú)菌條件下，從瓊脂斜面取8～10 mm2的一塊菌苔轉(zhuǎn)移至種子搖瓶中，置旋轉(zhuǎn)式搖床上28 ℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)72～96 h，然后按10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)100～120 h，即完成發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵液的凍干及提取 將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至不銹鋼凍干杯中，置凍干機(jī)中冰凍干燥，凍干條件為 -40 ℃預(yù)凍2 h，冷阱預(yù)冷至-45 ℃以下，開啟真空泵升華。真空度為10～30 Pa，升溫速率為2～3 ℃/h，極限溫度升為37 ℃。取出凍干粉后，小心轉(zhuǎn)移至三角瓶中，先用少量50%（V/V）甲醇-水濕潤(rùn)，再加入100 mL乙酸乙酯，于搖床上180 r/min振蕩萃取1 h，分離出酯相，旋蒸，除去溶劑，再以少量甲醇溶解后，送HPLC-MS分析。

1.2.3 生物活性測(cè)定 取1份發(fā)酵提取物，加入100 μL乙醇溶解，再加入900 μL去離子水，定容至1 mL。小菜蛾及棉鈴蟲采用24孔板進(jìn)行農(nóng)藥活性測(cè)定，方法為涂布法。蚜蟲農(nóng)藥活性測(cè)定采用浸葉法。組分農(nóng)藥活性測(cè)定采用相同的農(nóng)藥活性測(cè)定靶標(biāo)及方法。

1.2.4 提取物的液質(zhì)聯(lián)用分析及制備 分析色譜柱為美國(guó)Sunfire C18柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒徑3.5 μm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流動(dòng)相為去離子水和色譜純乙腈，梯度洗脫。半制備色譜柱為美國(guó)Sunfire OBD C18柱，250 mm×19 mm，粒徑為10 μm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為800 μL，流動(dòng)相為去離子水、乙腈，另加少量乙酸。質(zhì)譜檢測(cè)條件：電噴霧電離（ESI），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為70 V，離子源溫度為100 ℃，干燥氣溫度為300 ℃，脫溶劑氣體流速為500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。

1.2.5 提取物的初步鑒別 根據(jù)半制備組分農(nóng)藥活性測(cè)定結(jié)果，確定活性成分的出峰時(shí)間，從HPLC圖譜中，取得活性物質(zhì)的紫外吸收光譜，從而確定吸收峰的波長(zhǎng)。從ESI圖譜中可判定目標(biāo)產(chǎn)物的分子離子峰。將吸收峰波長(zhǎng)及分子量輸入Chapman天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，可查詢同該物質(zhì)性質(zhì)相同或相近的化合物名稱及其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并有理化及生物學(xué)性質(zhì)作比對(duì)，從而確定活性化合物的種類及其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 化合物純品的制備 采用制備型 HPLC，每次進(jìn)樣量800 μL，流動(dòng)相為乙腈和去離子水，加入少量乙酸，梯度洗脫，采用自動(dòng)收集器收集目標(biāo)組分，合并后用氮吹儀吹干?；衔锛兌葴y(cè)定采用HPLC-MS分析。

1.2.7 化合物純品的殺蟲活性評(píng)價(jià) 稱取純度在90%以上的化合物純品1 mg，加入100 μL乙醇溶解，其濃度為10 mg/mL，再以純水稀釋至1 000、333、100、50 μg/mL，采用涂布法進(jìn)行農(nóng)藥活性測(cè)定，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBERC-21542粗提取物農(nóng)藥活性

由表1可知，在A、B培養(yǎng)基上，發(fā)酵提取物均有殺蟲活性，但A培養(yǎng)基發(fā)酵提取物活性略差，這是由于在A培養(yǎng)基發(fā)酵條件下，該化合物很少或不產(chǎn)生的緣故。

2.2 HBERC-21542提取物組分農(nóng)藥活性測(cè)定

從表2中可以看出，具有殺蟲活性的組分出現(xiàn)在14～19 min，其余組分無(wú)活性。因此，判定活性峰應(yīng)在15 min前后。

2.3 HBERC-21542提取物的HPLC-MS及紫外吸收光譜

由圖1可知，10.63 min的峰為培養(yǎng)基雜峰，14.00 min為另一化合物的紫外吸收峰，活性化合物出現(xiàn)在15.17 min，而其正負(fù)離子流出現(xiàn)在15.26 min。

從圖2可以看出，保留時(shí)間為15.17 min的化合物紫外吸收峰在195 nm，屬末端吸收，可以認(rèn)為此化合物在紫外區(qū)沒有明顯的吸收。

2.4 HBERC-21542活性產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

從質(zhì)譜圖（圖3）中可以看出，在正負(fù)離子流模式中，質(zhì)量為627及629的兩個(gè)質(zhì)譜峰符合分子離子峰的特征，即其質(zhì)荷比分別為M+1及M-1，次高峰687符合M-1+CH3COOH（627+60=687）的特點(diǎn)。在高質(zhì)荷比區(qū)，分別有1 255及1 257質(zhì)量數(shù)的離子出現(xiàn)，其豐度較低，可以判定其為二聚體。根據(jù)質(zhì)譜圖的上述特征，可以確定該化合物的分子量約為628 D。

2.5 活性化合物的初步鑒定

將化合物分子量及紫外吸收峰波長(zhǎng)輸入Chapman化合物數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，條件為分子量介于627至629，紫外吸收峰值波長(zhǎng)λ=0（0表示無(wú)紫外吸收峰即末端吸收）。查詢得到兩個(gè)化合物Feresinmycin A[4，5]和lysocellin[6]，這兩種化合物實(shí)際上是同一化合物的不同名稱。因此，HBERC-21542的主要活性物質(zhì)為費(fèi)棱西霉素A。該化合物分子式為C34H60O10，分子量為628.842，結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

2.6 活性物質(zhì)純品的殺蟲活性評(píng)價(jià)

由表3可知，從室內(nèi)農(nóng)藥活性測(cè)定結(jié)果來(lái)看，該化合物對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲均有很強(qiáng)的殺蟲活性。

3 討論

在農(nóng)藥活性放線菌資源的篩選過程中，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心發(fā)現(xiàn)許多具有殺蟲及抗真菌活性的天然產(chǎn)物，如尼日利亞菌素、獵神霉素等，它們均具有聚醚類結(jié)構(gòu)。聚醚類抗生素對(duì)動(dòng)物球蟲類具有很強(qiáng)的殺蟲活性，如莫能菌素等，常用作飼料添加劑，很少見到聚醚類抗生素作為農(nóng)藥使用的報(bào)道，惟一報(bào)道的是南昌霉素[7]，它對(duì)很多農(nóng)業(yè)害蟲具有明顯的防治效果。

結(jié)果表明，聚醚類抗生素對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲具有較好的殺蟲活性，另有試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，此類抗生素也具有相當(dāng)廣譜的抗真菌活性，因此，聚醚類抗生素具有開發(fā)成為農(nóng)用抗生素的潛力。

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