孫翼飛,沈菊培,*,張翠景,韓國棟,紅 梅,趙巴音那木拉,賀紀(jì)正

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室,北京 100085 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院,呼和浩特 010019

放牧是草地生態(tài)系統(tǒng)主要的土地利用方式之一,動物的采食、踐踏和排泄等行為直接或間接的影響草地植物群落組成。有研究表明,放牧顯著降低了植物地上生物量,進(jìn)而影響植物對土壤氮素的吸收,降低生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力[1],且不同放牧強(qiáng)度下地上植物生產(chǎn)力及植物群落組成有顯著變化[2]。植物是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的紐帶,地上植物生物量、豐度及多樣性的變化勢必會影響地下生態(tài)系統(tǒng)功能及元素循環(huán)過程[3-4]。因此,放牧?xí)苯踊蜷g接的影響土壤微生物代謝、生長和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等。Xie和Wittig研究發(fā)現(xiàn),隨著放牧強(qiáng)度的增加,土壤有機(jī)質(zhì)、有機(jī)氮含量顯著降低[5]。輕度放牧?xí)黾油寥揽偟?促進(jìn)土壤氮素循環(huán),有利于提高土壤肥力,而重度放牧?xí)档屯寥烙行У?從而影響植物氮吸收[6]。放牧對植物生產(chǎn)力、土壤環(huán)境及氮素循環(huán)的影響已有大量的研究[7-8],而參與氮循環(huán)的土壤微生物對放牧強(qiáng)度的響應(yīng)機(jī)制還不十分明確[9]。

氨氧化作用是土壤硝化作用的限速步驟,是氮循環(huán)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10];氨氧化過程的產(chǎn)物硝酸鹽通過反硝化作用還原為一系列氮氧化氣體和氮氣,進(jìn)而導(dǎo)致土壤氮素的損失及溫室氣體排放增加[11-12],加劇全球氣候變化。土壤硝化及反硝化功能微生物在氮素可利用性、硝酸鹽淋溶和氮氧化氣體排放等方面起著關(guān)鍵作用。有研究表明,放牧顯著降低了荒漠草原氨氧化及反硝化微生物功能基因豐度,進(jìn)而顯著影響土壤中可利用氮含量及生態(tài)系統(tǒng)氮素流失[11]。輕度放牧可顯著刺激地下微生物活性,而中度和重度放牧通過改變土壤異養(yǎng)呼吸、礦化和硝化過程,進(jìn)而影響土壤氮庫[13- 15]。理解放牧對微生物介導(dǎo)的氨氧化過程和反硝化過程的影響及其反饋有助于認(rèn)識草地生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)過程及其對人類活動及氣候變化的響應(yīng)機(jī)制,為草地生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)及合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

北方溫帶草原是我國重要的生態(tài)屏障,在涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙、調(diào)節(jié)氣候、維持生物多樣性和提供畜牧產(chǎn)品等方面發(fā)揮著不可替代的作用。近幾十年來,我國草地不同程度地存在著過度放牧現(xiàn)象,草地退化嚴(yán)重。本研究依托于內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗試驗基地不同放牧強(qiáng)度的試驗,分析放牧強(qiáng)度對土壤理化性質(zhì)、氨氧化細(xì)菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea, AOA)微生物(amoA基因)及反硝化(如nosZ基因)功能微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響,以探索草地生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物對放牧干擾的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地與設(shè)計

試驗樣地位于內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗試驗基地(41°47′17″ N,111°53′46″ E),年平均氣溫在3.4 ℃,年平均降水量在110—250 mm之間。試驗區(qū)植被屬短花針茅荒漠草原的地帶性植被,草場處于半干旱草原和干旱半荒漠草原地帶。草地植物群落類型為短花針茅+冷蒿+無芒隱子草[16]。

放牧試驗開始于2004年,整個試驗區(qū)分為12個小區(qū),劃分為3個區(qū)組,每個區(qū)組有對照區(qū)、輕度放牧區(qū)、中度放牧區(qū)和重度放牧區(qū)4種處理,每個處理3個重復(fù)。各小區(qū)位置完全隨機(jī)分布,面積為4.40 hm2。放牧載蓄率分別為對照0只/hm2、輕度放牧0.93只/hm2、中度放牧1.82只/hm2、重度放牧2.71只/hm2[17]。供試羊為當(dāng)?shù)爻赡昝晒鹏裳?每年總放牧期為6個月,放牧從6月初開始,到11月末結(jié)束。試驗區(qū)綿羊每3年更換一次。

土壤采集于2014年5月底。每個小區(qū)以“S”形采集9個樣點,每個采樣點用直徑5 cm的土鉆取0—20 cm土壤,混合后作為該小區(qū)供試土樣。剔除土壤中可見的石塊和動植物殘體后,土樣帶回實驗室過2 mm篩后一部分保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于分子生物學(xué)分析;另一部分土樣自然風(fēng)干,用于測定土壤基本化學(xué)性質(zhì)。

1.2 土壤基本理化性質(zhì)和微生物活性測定

硝化潛勢及反硝化酶活性的測定分別采用氯酸鹽抑制法[11]和乙炔抑制法[12],主要步驟同文獻(xiàn)[18]。土壤異養(yǎng)呼吸是指微生物分解土壤有機(jī)質(zhì)后釋放CO2的過程,其測定方法如下：稱量10 g新鮮土壤加入到120 mL血清瓶中,在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h, 用氣相色譜儀(Agilent 7890A GC System)測定產(chǎn)生的CO2濃度[19]。

1.3 土壤DNA提取和實時定量PCR

稱取0.25 g凍干土,按照PowerSoilTMTotal DNA Isolation試劑盒(Mo Bio Laboratories, Inc., San Diego, CA, USA)所提供的方法提取土壤DNA。采用NanoDrop分光光度計(NanoDrop Technologies, USA)測定DNA的濃度和純度。DNA樣品存儲在-20 ℃,10倍稀釋后用作下游分子實驗的模板。

AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因的定量測定在iCycler iQ5儀器(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)上完成,使用的引物和擴(kuò)增條件如表1所示。采用SYBR GREEN作為熒光標(biāo)記,反應(yīng)體系為25 μL,包含12.5 μL 2 x SYBR Premix Ex TaqTM(Takara Biotechnology, Japan),前后引物各0.5 μL(10 μmol/L),2 μL的DNA模板(1—10 ng),其余用滅菌水補(bǔ)足。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒制備和提取參照之前文獻(xiàn)中發(fā)表的方法[23],十倍連續(xù)稀釋的質(zhì)粒用于構(gòu)建定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線,所有基因的擴(kuò)增效率均保證在85%—98%之間,R2為0.99。利用溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確保擴(kuò)增的特異性。

1.4 末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)

采用末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)方法來評估放牧強(qiáng)度對AOA-amoA,AOB-amoA和nosZ基因群落結(jié)構(gòu)的影響。其原理是用熒光標(biāo)記目標(biāo)DNA片段的末端(5′端),酶切后產(chǎn)生長度不等的末端限制性長度片段(T-RFs),經(jīng)測序后輸出帶有T-RFs長度大小及熒光強(qiáng)度的圖譜,圖譜含有的波峰越多,表明微生物種類越豐富[24]。通過對不同樣品圖譜間波峰的比較,可得到各功能基因群落結(jié)構(gòu)和多樣性在處理間的差異。土壤DNA的PCR擴(kuò)增采用表1所列引物,其中正向引物的5′末端用6-carboxyfluorescein(FAM)標(biāo)記熒光用于T-RFLP研究。PCR產(chǎn)物用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒(Promega, USA)純化。選取適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切純化后的產(chǎn)物,即AOA-amoA和nosZ基因采用的內(nèi)切酶是HhaI(TaKaRa Biotechnology, Japan),AOB-amoA基因采用內(nèi)切酶MspI(Takara Biotechnology, Japan)。反應(yīng)體系為20 μL,包括酶(4 U)和DNA樣品(約500 ng),在37 ℃下酶切3 h。反應(yīng)產(chǎn)物送至測序公司(TSINGKE, Beijing),利用ABI PRISM 3700 DNA分析儀(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行毛細(xì)管電泳,檢測酶切片段。使用GeneMarker軟件(SoftGenetics, USA)分析得到的圖譜,合并長度相差1 bp的片段。T-RFs的相對豐度用每個片段的峰面積除以總的峰面積表示,相對豐度不到1%的片段未參與計算。

表1 PCR所用的引物序列和反應(yīng)條件

(nosZ-F+nosZ2R) 用于nosZ基因的T-RFLP分析

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放牧強(qiáng)度對土壤理化性質(zhì)和微生物活性的影響

不同放牧強(qiáng)度對土壤理化性質(zhì)和微生物活性的影響見表2。隨放牧強(qiáng)度的增加,土壤pH波動范圍為7.90—8.18,在中度放牧處理中顯著增加(P=0.03)。放牧處理顯著增加了土壤銨態(tài)氮含量(P=0.02),其含量變化范圍為6.37—35.92 mg/kg,且在重度放牧處理中最高。不同放牧強(qiáng)度土壤異養(yǎng)呼吸相比未放牧處理均顯著降低(P=0.02),波動范圍為1.54—4.70 μL CO2g-1d-1。隨放牧強(qiáng)度增加,土壤含水量、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、硝化潛勢和反硝化酶活性無顯著影響。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),土壤pH與土壤呼吸顯著負(fù)相關(guān)(ρ=-0.66,P=0.02)。

2.2 不同放牧強(qiáng)度對氨氧化和反硝化功能基因豐度的影響

應(yīng)用定量PCR技術(shù)測定土壤氨氧化菌AOA-amoA、AOB-amoA基因及反硝化細(xì)菌nosZ基因的豐度(圖1)。不同放牧強(qiáng)度下AOA-amoA基因豐度無顯著差異(P=0.26),基因豐度范圍為每克干土(4.94—7.60)×109個拷貝數(shù)。放牧強(qiáng)度對AOB-amoA(P=0.04)和nosZ(P=0.03)基因豐度有顯著影響。AOB-amoA基因豐度波動范圍為每克干土(0.68—3.75)×106個拷貝數(shù),且在中度放牧處理中最低,與未放牧處理相比降低了18.1%。nosZ基因豐度范圍為每克干土(2.49—5.78)×108個拷貝數(shù),且在輕度放牧處理中最低,與未放牧處理相比降低了57.6%。

表2 不同放牧強(qiáng)度下土壤理化性質(zhì)與微生物活性

同一行數(shù)據(jù)后不同字母表示同一測量指標(biāo)在不同處理間差異顯著(Duncan檢驗),顯著性水平P< 0.05;表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

圖1 不同放牧強(qiáng)度下土壤AOA-amoA (a)、AOB-amoA (b)和nosZ (c)基因的豐度Fig.1 Abundance of AOA-amoA gene (a), AOB-amoA gene (b) and nosZ gene (c) across different grazing intensitiesCK：對照,control;LG：輕度放牧,low-level grazing;MG：中度放牧,middle-level grazing;HG：重度放牧,high-level grazing

Spearman相關(guān)分析表明,AOA-amoA基因豐度與土壤異養(yǎng)呼吸(Rh)顯著負(fù)相關(guān)(ρ=-0.69,P=0.01),AOB-amoA基因豐度與銨態(tài)氮含量顯著負(fù)相關(guān)(ρ=-0.60,P=0.04)。nosZ基因豐度與銨態(tài)氮含量顯著正相關(guān)(ρ=0.58,P=0.04),與土壤含水量(ρ=-0.78,P< 0.01)顯著負(fù)相關(guān)。

2.3 不同放牧強(qiáng)度對氨氧化和反硝化群落結(jié)構(gòu)的影響

不同放牧強(qiáng)度下AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因T-RFLP分析結(jié)果見圖2。使用HhaI酶對土壤AOA-amoA基因進(jìn)行酶切,主要得到5個限制性末端片段(T-RFs),其中T-RFs 541 bp、265 bp和352 bp為優(yōu)勢片段,其平均相對豐度分別為59.5%、21.4%和9.3%。AOB-amoA基因獲得6個主要T-RFs片段,其中T-RFs 70 bp、130 bp、154 bp和141 bp是主要的片段,其平均相對豐度分別為25.3%、24.7%、22.2%和20.7%。反硝化nosZ基因主要獲得6個片段,其中T-RFs 109 bp、190 bp、75 bp和204 bp為優(yōu)勢片段,其平均相對豐度分別為40.7%、18.2%、12.3%和10.8%。

圖2 不同放牧強(qiáng)度下土壤AOA-amoA (a)、AOB-amoA (b) 和nosZ (c) 基因T-RFs相對豐度Fig.2 Relative abundance of T-RFs of AOA-amoA gene (a), AOB-amoA gene (b) and nosZ gene (c) across different grazing intensities

以各功能基因T-RFs的相對豐度為依據(jù),以香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index)表征AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性。PerMANOVA結(jié)果表明,隨放牧強(qiáng)度的增加,AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性均呈顯著下降趨勢,且中度和重度放牧處理顯著低于輕度放牧處理(表3)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明,AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性與Rh顯著正相關(guān)(ρ=0.52,P=0.02;ρ=0.55,P< 0.05),AOA-amoA基因群落多樣性與SOC顯著正相關(guān)(ρ=0.44,P< 0.05)。

表3 不同放牧強(qiáng)度下AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因香農(nóng)指數(shù)

不同小寫字母表示同一測量指標(biāo)在不同處理間差異顯著(Duncan檢驗),顯著性水平P<0.05;表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

不同放牧強(qiáng)度對AOA-amoA基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(P=0.04),而對AOB-amoA和nosZ基因群落結(jié)構(gòu)無顯著性影響。應(yīng)用冗余分析(RDA)來評估微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系(圖3)。結(jié)果表明：前兩軸對AOA-amoA基因群落的解釋量分別為40.1%和10.4%,且土壤SOC (P=0.03)、銨態(tài)氮(P=0.02)及硝態(tài)氮(P=0.02)含量對AOA-amoA基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。前兩軸共同解釋了AOB-amoA基因群落結(jié)構(gòu)變異程度的45.7%,土壤pH(P=0.08)是顯著影響AOB-amoA基因群落變化的環(huán)境因子。前兩軸對nosZ基因群落結(jié)構(gòu)變異的解釋度為35.3%,且群落結(jié)構(gòu)變化與硝態(tài)氮含量(P< 0.05)顯著相關(guān)。

圖3 土壤AOA-amoA (a)、AOB-amoA (b) 和nosZ (c) 基因群落組成和環(huán)境變量的冗余分析Fig.3 Biplot of redundancy analysis (RDA) of relationship between soil properties and communities of AOA-amoA gene (a), AOB-amoA (b) and nosZ gene (c)pH：土壤pH,potential of hydrogen;soil moisture：土壤含水量,soil moisture;SOC：土壤有機(jī)碳,soil organic 銨態(tài)氮含量,ammonia 硝態(tài)氮含量,nitrate content

3 討論

3.1 不同放牧強(qiáng)度對土壤理化性質(zhì)和微生物活性的影響

放牧對土壤理化性質(zhì)的影響隨著放牧強(qiáng)度的不同而變化。本研究中土壤pH隨放牧強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,與未放牧處理相比,盡管中度放牧顯著增加了土壤pH(P=0.03),但二者僅相差0.2個單位。有研究表明,放牧?xí)@著增加土壤pH[25-26],但本研究中土壤pH變化幅度較小,不足以作為評估放牧強(qiáng)度對土壤功能微生物影響的主要指標(biāo)。放牧顯著增加了土壤銨態(tài)氮的含量,這與其他學(xué)者的研究相一致[27-28]。隨放牧強(qiáng)度的增加,進(jìn)入土壤中的牲畜排泄物增加,進(jìn)而增加土壤的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。土壤異養(yǎng)呼吸是土壤微生物活性的重要指標(biāo),反映了微生物對土壤有機(jī)質(zhì)分解的速度和強(qiáng)度。本研究中放牧強(qiáng)度顯著降低了土壤異養(yǎng)呼吸。米智勇在研究不同放牧強(qiáng)度對該試驗樣地土壤理化性質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn),隨放牧強(qiáng)度的增加,土壤碳氮比顯著下降,其波動范圍為9.56—10.26,波動幅度為0.67[29],說明微生物碳源含量的降低是土壤異氧呼吸顯著降低的原因之一。

3.2 不同放牧強(qiáng)度對土壤氨氧化和反硝化微生物的影響

氨氧化和反硝化微生物是土壤中重要的氮素轉(zhuǎn)化功能微生物,是土壤氨氧化和反硝化過程的主要參與者,其數(shù)量和活性與土壤生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)密切相關(guān)。有研究表明,放牧?xí)@著增加AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度[30]。但本研究中,隨放牧強(qiáng)度的增加,AOA-amoA基因豐度無顯著變化,AOB-amoA基因豐度顯著下降。造成這一結(jié)果的原因可能是：1)不同放牧處理顯著影響了土壤pH,但其值變異很小,始終在pH為8的范圍波動,而土壤AOA的基因豐度無顯著變化,這和我們前期的研究結(jié)果一致[31],即AOA盡管在土壤中保持很高的水平,但在堿性土壤中對氮的響應(yīng)比AOB更為不靈敏;2)有學(xué)者認(rèn)為,氨氧化功能微生物豐度更易受土壤理化性質(zhì)的影響,而非放牧處理的影響[32],土壤可利用性底物含量是影響土壤氨氧化微生物的重要因素[33]。隨著放牧強(qiáng)度增加,土壤銨態(tài)氮含量也顯著增加,而硝態(tài)氮在不同處理間無顯著差異,可能是采樣時間離放牧處理的時間較近,由于放牧強(qiáng)度增大致使銨態(tài)氮大量累積;而氨氧化微生物主要以土壤中NH3為底物[34],重度放牧處理后短時間內(nèi)土壤可利用的NH3含量有限,進(jìn)而顯著影響AOB的數(shù)量和群落多樣性,而隨著時間的推移,AOB微生物可利用的底物也會逐漸增加,達(dá)到一個穩(wěn)定的狀態(tài)。此外,放牧強(qiáng)度對AOA基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響,AOB基因群落結(jié)構(gòu)無顯著變化。RDA結(jié)果顯示土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量對AOA群落具有顯著影響,說明由放牧所導(dǎo)致的以牲畜排泄物形式進(jìn)入土壤中的可利用氮含量增加是導(dǎo)致AOA群落結(jié)構(gòu)變化的主要原因之一。

本研究中nosZ基因豐度與土壤銨態(tài)氮含量顯著正相關(guān)。有研究表明,nosZ基因參與了反硝化作用的最后一步,其豐度主要受底物含量、土壤通氣狀況及土壤pH等環(huán)境條件的影響[35]。放牧顯著降低了AOB基因豐度,即降低了反硝化底物硝態(tài)氮的含量,且硝態(tài)氮含量在輕度放牧處理中最低,進(jìn)而輕度放牧處理顯著降低了nosZ基因豐度,但隨放牧強(qiáng)度的增加,土壤緊實度增加,通氣性降低,促進(jìn)反硝化細(xì)菌的生長,進(jìn)而增加了nosZ基因豐度。有研究指出nosZ基因豐度隨放牧強(qiáng)度的增加無顯著變化[36],這主要與研究區(qū)域的地理位置、植物群落、土壤類型等因素有關(guān)[37],同時,目前關(guān)于放牧強(qiáng)度界定(輕度、中度和重度)的差異也是造成上述結(jié)果不一致性的重要原因。此外,RDA結(jié)果表明土壤硝態(tài)氮含量對nosZ基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響,說明隨著放牧強(qiáng)度的增加,由牲畜采食踐踏所導(dǎo)致的土壤有機(jī)質(zhì)礦化加劇,顯著影響土壤中可利用氮含量,進(jìn)而影響土壤nosZ基因群落結(jié)構(gòu)[38-39]。

4 結(jié)論

(1)土壤pH和銨態(tài)氮含量分別在7.90—8.18和6.37—35.92 mg/kg之間,中度放牧處理顯著增加了土壤pH(P=0.03),而銨態(tài)氮含量在重度放牧處理中最高(P=0.02)。不同放牧強(qiáng)度下土壤異養(yǎng)呼吸相比未放牧處理均顯著降低(P=0.02)。

(2)AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度范圍分別為每克干土(4.94—7.60)×109個拷貝數(shù)和(0.68—3.75)×106個拷貝數(shù),放牧處理對AOA-amoA基因豐度無顯著影響,中度放牧處理顯著降低了AOB-amoA基因豐度(P=0.04);反硝化微生物nosZ基因豐度范圍為每克干土(2.49—5.78)×108個拷貝數(shù),且在輕度放牧處理中最低(P=0.03)。土壤銨態(tài)氮含量是影響AOA和AOB功能基因amoA豐度的主要因子,而nosZ基因豐度主要受反硝化底物含量及土壤通氣狀況影響。

(3)放牧顯著影響了AOA-amoA基因群落結(jié)構(gòu),而AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性均隨放牧強(qiáng)度的增加而降低,且中度和重度放牧顯著低于輕度放牧。由放牧所引起的可利用氮素含量的變化是導(dǎo)致氨氧化和反硝化微生物群落顯著變化的主要因素。

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