郭明璋 劉海燕 杜若曦 許文濤

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063210）

許多技術(shù)的發(fā)展都有一個從低通量到高通量的過程。高通量技術(shù)通常具有全面、準(zhǔn)確、高效和低廉等優(yōu)勢。在信息科學(xué)領(lǐng)域，大數(shù)據(jù)技術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了對信息的高通量分析，已經(jīng)改變了人類生活的各個方面［1］；在生物技術(shù)領(lǐng)域，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)及不斷創(chuàng)新發(fā)展從根本上改變了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏基因組學(xué)甚至整個生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)研究思路和方式［2-4］。基因編輯技術(shù)是繼基因測序技術(shù)后又一項具有廣泛應(yīng)用前景的熱點生物技術(shù)。科學(xué)家在通過基因測序技術(shù)對生物的基因組進行“閱讀”后，必然會希望通過基因編輯技術(shù)對生物基因組進行“改寫”［5］，以研究基因的功能與特性，進而對基因進行改造和優(yōu)化。然而與基因測序的高通量程度相比，基因編輯的高通量化尚處在探索和雛形階段（圖1）?；蚓庉嫺咄炕膶崿F(xiàn)將使基因編輯技術(shù)實現(xiàn)質(zhì)的飛躍，也將是推進基因編輯產(chǎn)業(yè)化的重要動力。

圖1 基因測序技術(shù)和基因編輯技術(shù)發(fā)展進程

多元基因編輯技術(shù)是實現(xiàn)高通量基因編輯的重要中間過程，類似于測序技術(shù)的發(fā)展歷程中的利用毛細管電泳進行多重平行測序階段（如ABI公司3730XL型號的96道毛細管測序儀）。多重平行測序是利用傳統(tǒng)Sanger測序的原理，通過測序設(shè)備的改進與優(yōu)化，實現(xiàn)了測序效率的提升［6］。同樣，目前最為成熟的微生物多元基因編輯技術(shù)——基因組多重位點自動改造技術(shù)（Multiplex automated genome engineering，MAGE）［7］，也是利用傳統(tǒng)單一基因編輯技術(shù)的原理，通過自動化循環(huán)設(shè)備的設(shè)計，實現(xiàn)了基因編輯效率的提升。無論從基因編輯的靶基因數(shù)量級，還是從基因編輯原理的突破性來看，目前的多元基因編輯技術(shù)尚不能稱作“高通量”。從“單一”到“多元”是量變的過程，而從“多元”到“高通量”是質(zhì)變的過程?，F(xiàn)階段的多元基因編輯正在為高通量基因編輯的出現(xiàn)積累著技術(shù)創(chuàng)新。

與基因測序技術(shù)不同，基因編輯技術(shù)在不同生物中的發(fā)展存在很大差異。同動植物相比，細菌的基因編輯極有可能更早實現(xiàn)多元和高通量。首先，隨著細菌合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，研究者經(jīng)常需要對細菌基因組進行全方位編輯，甚至改變細菌基因組的密碼子系統(tǒng)［8］，這使高通量基因編輯技術(shù)在細菌領(lǐng)域具有更加迫切的需求，迫切的需求往往推動著新技術(shù)的發(fā)展。其次，細菌易于培養(yǎng)，繁殖迅速，可以縮短研究時間，且細菌群落中個體數(shù)量龐大，更易篩選到目標(biāo)個體。再次，相較于動植物基因編輯，細菌基因編輯的方法更加多樣，實現(xiàn)高通量基因編輯的選擇性更多。

本文綜述了近10年來細菌領(lǐng)域多元基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對基于各種原理的多元基因編輯技術(shù)進行比較，并探討了它們進一步實現(xiàn)高通量基因編輯的可能性。在此基礎(chǔ)上，本文對多元基因編輯技術(shù)在微生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用進行了介紹和展望。

1 細菌基因編輯的基本工具與原理

1.1 位點特異性基因重組系統(tǒng)

Cre-lox重組系統(tǒng)和FLP-FRT重組系統(tǒng)都是位點特異性基因重組技術(shù)。Cre-lox系統(tǒng)來源于大腸桿菌（Escherichia coli）P1噬菌體，可以促使噬菌體DNA插入到細菌基因組中［9-10］。Cre為重組酶，可以識別長度為34 bp具有方向性的loxP位點。同一DNA分子上同向的兩個loxP位點發(fā)生重組，可以刪除兩個loxP位點之間的DNA片段；同一DNA分子上反向的兩個loxP位點發(fā)生重組，可以使兩個loxP位點之間的DNA片段發(fā)生倒置；具有單個loxP位點的環(huán)狀DNA序列與第二個DNA分子的loxP位點發(fā)生重組，可以將環(huán)狀序列插入到第二個DNA分子的loxP位點上。loxP位點在自然界基因組中出現(xiàn)的概率極低，因此在進行基因編輯時，首先要在受體基因組上引入loxP位點，再誘導(dǎo)Cre重組酶的表達并催化loxP位點之間發(fā)生重組。在細菌基因編輯中，Cre-lox重組系統(tǒng)常用作刪除選擇標(biāo)記基因、大片段基因的刪除和倒置等。Cre重組酶發(fā)揮作用不需要任何輔助因子，Cre-lox重組系統(tǒng)具有廣譜性，理論上可以在任何細胞環(huán)境的任何類型DNA分子上發(fā)揮有效作用。Flp-FRT系統(tǒng)是Cre-lox系統(tǒng)在真核細胞內(nèi)的同源系統(tǒng)，與Cre-lox系統(tǒng)的工作原理極為相似，F(xiàn)lp為重組酶，識別具有方向性的FRT位點（圖2）［11］。

圖2 基因編輯基本工具的工作原理

1.2 同源重組系統(tǒng)

λ-Red同源重組系統(tǒng)包含3個來源于λ噬菌體Red操縱子的基因，其中λ Gam蛋白抑制RecBCD酶的活性，以保護外源線性DNA免受降解。λ Exo是以雙鏈DNA（Double-stranded DNA，dsDNA）為底物的核酸外切酶，可以催化5'-3'方向的降解，而產(chǎn)生3'-5'的線性單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），當(dāng)dsDNA的一條鏈被降解后，產(chǎn)生的ssDNA將不會被λ Exo降解。λ Beta蛋白可以結(jié)合在ssDNA上起到保護作用，引導(dǎo)同源配對促進同源重組的發(fā)生［12］。RecE/T重組系統(tǒng)與λ-Red同源重組系統(tǒng)作用機制類似，RecE蛋白發(fā)揮與λ Exo蛋白相似的功能，RecT蛋白發(fā)揮與λ Beta蛋白相似的功能［13］。RecE/T系統(tǒng)缺少RecBCD酶的抑制蛋白。進行基因編輯時，在細菌中引入兩端具有與受體基因組DNA同源片段的外源dsDNA分子，借助于λ-Red重組系統(tǒng)或RecE/T重組系統(tǒng)，誘發(fā)同源片段中間的外源DNA序列與基因組序列發(fā)生交換，從而可實現(xiàn)基于同源重組的基因編輯。

傳統(tǒng)的λ-Red同源重組系統(tǒng)是在細菌中引入dsDNA，Ellis等［14］在2001年提出利用70-90 bp長度的ssDNA為底物可以簡化λ-Red系統(tǒng)，不需要λ Exo介導(dǎo)的產(chǎn)生單鏈的過程。目前比較接受的機制為退火學(xué)說（Strand annealing），即無論是在細菌中引入同源dsDNA后通過λ Exo外切酶產(chǎn)生的ssDNA，還是在細菌中直接引入的ssDNA，都會在λ Beta蛋白保護和介導(dǎo)下以岡崎片段的方式結(jié)合到DNA復(fù)制過程中的后隨鏈上，產(chǎn)生一個野生型基因組和一個異源雙鏈的基因組。隨后具有異源雙鏈基因組的細菌細胞再經(jīng)過一次DNA復(fù)制和細胞分裂產(chǎn)生一個野生型基因組和一個突變型基因組［15］。

1.3 靶向核酸酶

鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN），轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effectors nuclease，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9核酸酶是在基因編輯中應(yīng)用最為廣泛的3種核酸酶。ZFN通過鋅指結(jié)構(gòu)識別特定的核酸序列，通過Fok I核酸內(nèi)切酶活性切割DNA［16］；TALEN通過轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物識別特定的核酸序列，通過Fok I核酸內(nèi)切酶活性切割DNA［17］；目前的CRISPR/Cas9通過向?qū)NA（guide RNA，gRNA）識別特定的核酸序列，通過Cas9的核酸酶活性切割DNA［18］。靶向核酸酶在特定位點對DNA進行切割，產(chǎn)生了DNA雙鏈斷裂（Doublestrand DNA break，DSB），在原核細胞中DSB的產(chǎn)生可促進該位點同源重組的發(fā)生率，在真核細胞中還可通過非同源末端連接修復(fù)產(chǎn)生移碼突變而實現(xiàn)基因的功能性敲除。此外，在真核細胞中通過改造的Cas9與堿基編輯酶進行蛋白融合，還可實現(xiàn)對特定區(qū)域的堿基進行定點編輯。

1.4 可移動II型內(nèi)含子

可移動II型內(nèi)含子（Mobile group II introns）廣泛存在于細菌和真核生物細胞中，是位點特異性逆轉(zhuǎn)錄因子。II型內(nèi)含子具有核酶活性，經(jīng)過自剪接后脫離mRNA，形成套索結(jié)構(gòu)，并可以編碼內(nèi)含子編碼蛋白（Intron-encoded protein，IEP）。IEP可以結(jié)合在內(nèi)含子上形成核糖核蛋白復(fù)合物并入侵特定的DNA位點，通過核酶位點的反向剪接能力將自身整合到DNA一條鏈上，隨后通過IEP的反轉(zhuǎn)錄活性形成完整的DNA雙鏈，這一過程被稱為“歸巢（Retrohoming）”。II型內(nèi)含子通過其EBS1和EBS2區(qū)域的堿基與靶標(biāo)DNA的進行互補配對而實現(xiàn)對特定靶標(biāo)DNA位點的識別，因此可以通過編輯EBS1和EBS2區(qū)域的堿基序列，改變II型內(nèi)含子識別位點［19］。在細菌中，通過在編碼基因中插入II型內(nèi)含子，可以實現(xiàn)對該基因的功能性敲除［20］。

2 細菌多元基因編輯的基本策略

與單個基因編輯相比，多元基因編輯的成功率較低。從概率上分析，若每一個基因編輯的成功率為pi，則使n個相互獨立的基因在同一個細胞內(nèi)全部編輯成功率為PM=。多元編輯當(dāng)n很大時，PM值將非常小。若想要提高PM值，理論上有兩種基本策略：一是提高每個基因編輯的效率使pi更接近于1；二是減少n的值（圖3）。

圖3 提高細菌多元基因編輯效率的基本策略

提高pi可以通過多種方式實現(xiàn)。首先，最根本的方式是改進基因編輯技術(shù)，包括對原有基因編輯技術(shù)的參數(shù)優(yōu)化，和開發(fā)新的高效基因編輯技術(shù)。其次，在已有基因編輯技術(shù)不提升的情況下，pi值的提高可以通過迭代來實現(xiàn)。在同一個細胞及其子代中某一位點進行N次迭代基因編輯，則該位點基因編輯成功的概率為p’=1-（1-p）N。由此可見，迭代次數(shù)N越大，則p’越接近于1，多元基因編輯成功率PM越大。此外，在無法改變基因編輯效率的情況下，可以通過選擇壓力殺死未成功編輯細胞，以提高成功編輯的細胞的比例。在多元編輯中，不可能針對每一個基因靶標(biāo)設(shè)計一個選擇壓力，否則一方面會在基因組上留下過多的選擇標(biāo)記；另一方面當(dāng)基因編輯效率較低時，多種選擇壓力可能會殺死所有細胞。但由于“共選擇”和“共轉(zhuǎn)化”等現(xiàn)象的存在，可以通過適當(dāng)?shù)脑O(shè)計，通過少量的選擇標(biāo)記完成對所有基因編輯的選擇。

降低n的數(shù)值可以通過將多個靶標(biāo)基因進行連鎖來實現(xiàn)。對于基因敲入，可以將多個基因整合到一個操縱子上。對于受體基因組上不連續(xù)位點的基因敲除或者基因編輯，則可以通過基因合成的方法構(gòu)建跨越多個靶基因位點的同源大片段，然后將合成的大片段與受體基因組進行同源重組。

3 基于迭代編輯的方法

3.1 MAGE技術(shù)和CAGE技術(shù)

多元自動基因編輯（MAGE）技術(shù)是由Wang和Isaacs等［7］于2009年提出的。MAGE的基本思想是通過迭代提高多元基因編輯的成功率。迭代策略在理論上適用于任何基因編輯技術(shù)，但迭代基因編輯也會使工作量和工作時間成倍增加。他們選擇了操作相對簡單的λRED系統(tǒng)，并以人工合成的ssDNA為同源重組反應(yīng)底物。MAGE技術(shù)需要在受體大腸桿菌的基因組上整合溫控啟動子控制表達的λRED系統(tǒng)（Exo、Beta和Gam），并敲除基因組上mutS基因以抑制細菌錯配修復(fù)。MAGE的每次基因編輯操作包括以下步驟：（1）細胞培養(yǎng)至對數(shù)中期；（2）在42℃誘導(dǎo)λ Beta蛋白的表達；（3）將細胞置于4℃；（4）用無菌蒸餾水洗去培養(yǎng)基并重懸細胞；（5）加入ssDNA；（6）電轉(zhuǎn)化；（7）恢復(fù)培養(yǎng)，重新回到步驟1進入下一個循環(huán)［21］。MAGE可以通過設(shè)備實現(xiàn)自動化循環(huán)。MAGE的效率可以高達每個循環(huán)完成35%的基因編輯，隨著編輯區(qū)域（不匹配區(qū)域）的增長，編輯效率會有所下降。當(dāng)進行每個靶位點18個堿基的插入時，MAGE的每個循環(huán)的編輯效率為 2%-5%［22］。

2011年，Isaacs等［23］在對大腸桿菌全基因組314個終止密碼子TAG進行編輯時，又提出（Hierarchical conjugative assembly genome engineering，CAGE）的策略，即將整個基因組DNA劃分為32個區(qū)域，其中31個區(qū)域包含10個終止子靶標(biāo)，另一個區(qū)域包含4個終止子靶標(biāo)。進行基因編輯時，先在不同細胞群中對每個區(qū)域內(nèi)的TAG終止子分別進行編輯，再將編輯好的基因組區(qū)域通過接合方式進行分層合并，最終產(chǎn)生基因組中同時包含32個成功編輯區(qū)域的細胞。作者設(shè)計CAGE，而非在一次MAGE中加入所有314個TAG終止子編輯同源ssDNA的目的，主要是通過減少每個MAGE的靶標(biāo)數(shù)。每次MAGE反應(yīng)的靶標(biāo)數(shù)減少，不僅可以減少λRED系統(tǒng)工作時導(dǎo)致的細菌基因組非期望突變的增加，而且便于對靶標(biāo)的篩選和重組率的計算。CAGE技術(shù)可以實現(xiàn)微生物全基因組的精準(zhǔn)編輯［24］。

3.2 CoS-MAGE技術(shù)

共選擇多元自動基因編輯（CoSelection MAGE，CoS-MAGE）是對MAGE的改進。在對MAGE研究的過程中，研究者們無意發(fā)現(xiàn)在每一次MAGE循環(huán)過程中，都有某些菌落的細菌中包含不止一個位點的基因編輯，這暗示了當(dāng)細胞中發(fā)現(xiàn)某一個突變位點，則該細胞中發(fā)現(xiàn)其他突變位點的概率會增加［25］，該現(xiàn)象有可能緣于某些細胞亞群可能更適于電轉(zhuǎn)化或更適于ssDNA的同源重組，這一現(xiàn)象被稱為CoSMAGE［25-26］。因此，可以在作為靶標(biāo)基因同源重組底物的ssDNA寡核酸庫中加入小部分共選擇寡鏈核苷酸（CoS oligo），將基因組上失活的選擇標(biāo)記（galK-，malK-，cat-和bla-）進行回復(fù)突變，以通過營養(yǎng)選擇或抗生素選擇及共選擇現(xiàn)象，提高MAGE中成功編輯細胞的比例。對12個靶基因編輯實驗結(jié)果表明，經(jīng)過2個MAGE循環(huán)的基因編輯，傳統(tǒng)MAGE的陽性率為2%-3%，而CoS-MAGE的陽性率可以達到25%。進一步研究表明，當(dāng)CoS oligo的作用位點和靶標(biāo)基因位點之間的距離在500 kb之內(nèi)時，可以在一個循環(huán)內(nèi)通過1個CoS oligo的篩選作用獲得8個靶標(biāo)基因的編輯體。

3.3 pORTMAGE

由于MAGE依賴于ssDNA結(jié)合到復(fù)制的基因組上，形成異源雙鏈，因此在MAGE過程中，必須要抑制細菌內(nèi)源錯配修復(fù)機制。傳統(tǒng)的MAGE中使用mutS基因突變的菌株，因此限制了MAGE使用的廣譜性，并且提高了背景基因組發(fā)生非期望突變的概率。2016年Nyerges等［27］開發(fā)了pORTMAGE質(zhì)粒，該質(zhì)?？梢詼乜乇磉_催化位點失活的MutL基因。MutL蛋白是MutHLS復(fù)合物的組分之一，催化位點失活的MutL蛋白可以破壞MutHLS的功能。當(dāng)催化位點失活的MutL基因不表達時，野生型MutL蛋白可以使細菌恢復(fù)錯配修復(fù)機制，而降低背景基因組的非期望突變率。因此，pORTMAGE可以使野生型細菌菌株實現(xiàn)低背景錯配率的MAGE循環(huán)。

3.4 MuGENT

MAGE技術(shù)及其衍生出的CoS-MAGE技術(shù)和pORTMAGE技術(shù)都是將迭代編輯思想應(yīng)用在ssDNA介導(dǎo)的基因重組，這一過程需要λRED系統(tǒng)的催化和細菌錯配修復(fù)機制的抑制。Dalia等［28］于2014年提出了將迭代編輯的思想與轉(zhuǎn)化（Transformation）相結(jié)合的MuGENT技術(shù)方案。轉(zhuǎn)化在很多細菌中都會自然發(fā)生，與ssDNA介導(dǎo)的基因重組相比，基于轉(zhuǎn)化的基因編輯對受體細胞沒有基因型的要求，應(yīng)用的菌株范圍更加廣泛。與CoS MAGE的共選擇效應(yīng)類似，轉(zhuǎn)化的過程中也會發(fā)生非連續(xù)基因的共轉(zhuǎn)化。MuGENT可基于共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象通過標(biāo)記基因的篩選而提高獲得靶基因成功編輯菌群的概率。Dalia等將MuGENT應(yīng)用在革蘭氏陰性的霍亂弧菌（Vibrio cholerae）和革蘭氏陽性的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）上，都取得了較高的成功率。

3.5 TRMR-MAGE

可追溯多元編輯（Trackable multiplex recombineering，TRMR）是Warner等［29］在2010年提出的用于研究基因功能的方法。該方法并非實現(xiàn)在一個細胞中進行多基因編輯，而是針對細胞群中的每一個細胞進行不同靶標(biāo)的單基因編輯，提升靶標(biāo)基因的表達量，之后將細胞群置于選擇壓力下，對選擇壓力有抗性的細胞亞群將會得到富集，而它們基因組中標(biāo)記的靶標(biāo)基因也因而得以富集。通過對靶標(biāo)基因比例變化分析，可以分析與此選擇壓力相關(guān)的功能基因。

Sandoval等［30］在 2012年提出 TRMR 可以與MAGE聯(lián)用。嚴格來講，TRMR-MAGE并不是多元編輯技術(shù)的創(chuàng)新。與其他MAGE的衍生技術(shù)不同，TRMR-MAGE并非優(yōu)化MAGE技術(shù)的成功率，而是通過TRMR來篩選MAGE的靶標(biāo)。利用TRMR分析與某一選擇壓力相關(guān)的基因，再通過MAGE技術(shù)同時編輯這些基因，從而獲得對該選擇壓力的高抗性菌株。

4 應(yīng)用CRISPR/Cas9核酸酶的多元基因編輯方法

提高單個基因編輯的成功率pi的方法最根本的是改進基因編輯工具。CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)來源于細菌的免疫防御系統(tǒng)，其高效性和在真核生物中的廣泛應(yīng)用激發(fā)了微生物學(xué)家的興趣。CRISPR/Cas9在細菌單個基因編輯中有許多成功的案例，如Jiang等［31］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯了大腸桿菌中的rpsL基因，成功率達到65%。CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)對識別位點切割產(chǎn)生的DSB對于許多細菌來說往往是致命的［32］，在某些細菌中，單個基因的DSB可以通過同源重組或非同源末端連接的方式進行修復(fù)并促進基因編輯的發(fā)生，但對于多元基因編輯來說，CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的多個DSB通常會導(dǎo)致細菌死亡。因此，目前將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用在多元基因編輯的案例并不多。

4.1 CRMAGE技術(shù)

2015年，Ronda等［33］提出了在 MAGE技術(shù)中應(yīng)用CRISPR/Cas9靶向野生型基因，切割未發(fā)生同源重組的基因組，使野生型細菌死亡，從而提高MAGE中基因編輯細菌的比例，這種CRISPR/Cas9與MAGE聯(lián)用的策略被命名為CRMAGE。對于3個靶標(biāo)基因的編輯，CRMAGE可以將成功率從MAGE技術(shù)的0.68%-5.4%提升到96.5%-99.7%。

4.2 CRISPRNickases

野生型Cas9蛋白有兩個活性位點，分別切割DNA的兩條鏈，從而產(chǎn)生DSB。如果利用野生型Cas9蛋白和靶向多個位點的sgRNA進行多元基因編輯，會在基因組上產(chǎn)生多個DSB。大部分細菌無法及時對多個DSB進行修復(fù)而導(dǎo)致基因組片段化，致使細胞死亡（圖4）。當(dāng)將Cas9的一個切割位點突變失活后（如Cas9D10A），Cas9將只能切割DNA的一條鏈而變成切刻酶［34］。如圖4所示，切刻版Cas9產(chǎn)生單鏈DNA斷裂（Single Stranded DNA Breaks，SSB），由于另一條鏈的連接作用，即使在基因組上產(chǎn)生多個SSB，也不會導(dǎo)致基因組片段化，因此對細菌來說是非致命的。基因組上SSB的產(chǎn)生可以促進同源重組的發(fā)生，因此切刻版Cas9可以應(yīng)用在多元基因編輯中［32］。Standage-Beier［32］于 2015 年報道了切刻版Cas9用于大腸桿菌多位點基因敲除的研究，該研究將多個sgRNA整合到質(zhì)粒pSG4K5上，通過對多位點的切刻，促進了切刻位點附近的同源重組的發(fā)生，刪除了133 kb的基因組DNA片段。

圖4 多位點雙鏈斷裂與多位點單鏈斷裂比較示意圖

4.3 Orthogonal Cas9技術(shù)

除了野生型Cas9作為核酸酶及改造Cas9作為切刻酶外，還可以對Cas9進行其他形式的改造以形成Cas9激活子（Cas9 Activator）來激活基因表達、或Cas9抑制子（Cas9 Inhabitior）來抑制基因表達等。但是在同一細胞內(nèi)，源于同一種Cas9蛋白的不同改造型不能同時發(fā)揮作用。例如，一個細胞基因組中整合了來自于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9激活子后，無法用S. pyogenes野生型Cas9進行基因編輯。Esvelt等［35］研究了來自不同的細菌［（S. pyogenes），嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）和齒垢密螺旋體（Treponema denticola）］Cas9的對識別位點序列的偏好性，開發(fā)了Orthogonal Cas9方法，利用不同細菌來源的Cas9蛋白，同時對一個細胞的不同基因進行基因編輯和基因調(diào)控。

5 基于大片段DNA合成組裝的多元基因編輯

Krishnakumar等［36］于2014年報道了通過大片段DNA合成而實現(xiàn)多元編輯的案例。他們首先人工合成了長達72 kb的dsDNA片段，通過Cre-lox重組系統(tǒng)將此人工合成的片段與大腸桿菌基因組上126 kb的同源片段進行重組，重組后實現(xiàn)了對126 kb內(nèi)多個不連續(xù)基因的敲除，最后再通過λRED系統(tǒng)去除基因組上的lox位點，從而實現(xiàn)無痕操作。此過程相當(dāng)于把多個小片段基因編輯操作轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€大片段基因編輯操作，人為將基因組上多個不連續(xù)基因進行連鎖，從概率的角度看，也相當(dāng)于破壞了各個基因敲除成功事件之間的獨立性。

與迭代方法相比，基于大片段DNA合成的多元基因編輯耗時更短，適用細菌范圍更廣，并且可以實現(xiàn)基因敲除、基因敲入、堿基替換等多種形式的基因編輯。隨著DNA合成費用的降低，這一方法將有更廣泛的應(yīng)用。

6 細菌多元基因編輯技術(shù)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用方向

6.1 細菌基因組無害化和最小化

現(xiàn)階段合成生物學(xué)多數(shù)是利用細菌基因組作為功能系統(tǒng)構(gòu)建的骨架。細菌基因組一般包含2-6 Mb個堿基，雖然比真核生物基因組小的多，但細菌基因組中包含許多毒力基因使細菌具有病原性，包含許多重組DNA和可移動DNA使細菌基因組具有不穩(wěn)定性，包含許多無意基因、非必需基因和未知功能基因增加了基因組的復(fù)雜性，并且可能會占用一定的核苷酸、氨基酸、核糖體等資源，影響合成生物學(xué)系統(tǒng)的工作。因此，自然界中的細菌菌株或只經(jīng)過少量突變改造的細菌菌株并非合成生物學(xué)的理想受體。將細菌基因組中非必需基因進行刪除，得到無害化和最小化的細菌基因組，作為合成生物學(xué)基因編輯的受體骨架，將有利于獲得安全、穩(wěn)定、高效的合成生物學(xué)系統(tǒng)。

Pósfai等［37］于2006年報道了對大腸桿菌K-12菌株基因組的最小化處理，通過刪除非必需基因、重組基因和可移動原件和潛在的毒理基因，使基因組減小了15%的長度。研究者意外的發(fā)現(xiàn)，基因組可以使菌株產(chǎn)生高電轉(zhuǎn)效率和重組的準(zhǔn)確率。此研究并未采用多元基因編輯的方法，而是對每一個靶標(biāo)片段分別進行敲除，工作量較大?，F(xiàn)階段，通過CRISPRNickases技術(shù)的多元靶標(biāo)同時敲除，可以高效的完成基因組最小化。

6.2 細菌基因組中大片段插入

合成生物學(xué)需要在受體細胞中引入新的基因元件以使細胞完成相應(yīng)的功能。目前大部分合成生物學(xué)案例將新基因元件置于高拷貝質(zhì)粒上，而非整合到受體基因組中，這樣設(shè)計的優(yōu)點是操作簡便，功能基因元件的表達量高，但也存在功能元件表達量不穩(wěn)定，易丟失等缺點，并且質(zhì)粒具有更高的細胞間轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，存在環(huán)境安全性隱患。因此將功能元件整合到基因組上可能是未來合成生物學(xué)發(fā)展趨勢。外源多元基因插入可以通過大片段DNA合成整合技術(shù)實現(xiàn)。

6.3 細菌基因組密碼子系統(tǒng)改造

大部分生物的基因組都采用同一套密碼子系統(tǒng)，因此通常情況下外源基因可以在受體細胞中正常表達。當(dāng)某些外源基因表達的蛋白質(zhì)中含有稀有氨基酸時，受體細胞中沒有與稀有氨基酸相對應(yīng)的密碼子和tRNA，則需要對受體基因組的密碼子進行改造。例如，產(chǎn)甲烷古菌的甲基轉(zhuǎn)移酶可以用于生物能源的生產(chǎn)，該酶中含有稀有氨基酸——吡咯賴氨酸，在古菌中由UAG編碼［38］。UAG在細菌中是終止密碼子，因此若要在細菌中表達甲基轉(zhuǎn)移酶以生產(chǎn)甲烷，則需要將細菌受體基因組中原有的UAG全部改為UAA或UGA，敲除受體基因組上的釋放因子1（Release Factor 1），并引入吡咯賴氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。Isaacs等［23］通過MAGE-CAGE技術(shù)，成功的將大腸桿菌菌株基因組中所有的314個TAG終止密碼子改寫為TAA。

通用的密碼子系統(tǒng)使用64個密碼子編碼20個氨基酸，其中存在密碼子簡并現(xiàn)象。密碼子簡并可以減少有害突變，維持物種穩(wěn)定性，但也導(dǎo)致了密碼子信息的浪費。Ostrov等［39］則通過大片段合成與λRED系統(tǒng)相結(jié)合的方法，構(gòu)建了基因組中只使用57個密碼子的大腸桿菌。7個未使用的密碼子AGA、AGG、AGC、AGU、UUA、UUG 和 UAG 便可以用于轉(zhuǎn)運稀有氨基酸或其他特殊氨基酸。隨著人類對蛋白結(jié)構(gòu)認識的不斷深入，在蛋白質(zhì)中引入特殊氨基酸可能會使蛋白質(zhì)功能更加豐富。

6.4 受體細菌基因組代謝物的調(diào)控

相比于人工配制的緩沖液體系，微生物細胞質(zhì)液是十分復(fù)雜的環(huán)境，其中的代謝物種類和濃度會影響合成生物學(xué)菌株的功能效率。在合成生物學(xué)設(shè)計時，可能需要對宿主某些代謝物的產(chǎn)量進行調(diào)控。例如細菌細胞中某些必需代謝物會抑制功能元件的活性，不能通過基因敲除完全去除，只能通過調(diào)低這些抑制物生產(chǎn)相關(guān)的基因，降低抑制物在細胞質(zhì)中的濃度。又如細胞中的某些代謝物可能有助于功能元件的活性，需要調(diào)高相關(guān)基因的表達，以提高功能元件的效率。生物體內(nèi)代謝物的產(chǎn)量通常受多個基因的調(diào)控，調(diào)節(jié)這些基因的表達量，可以通過編輯它們的啟動子實現(xiàn)。Wang等［25］利用CoSMAGE技術(shù)，將12個與芳香族氨基酸衍生物合成相關(guān)基因的啟動子同時編輯為T7啟動子，成功優(yōu)化了芳香族氨基酸衍生物的產(chǎn)量。

7 總結(jié)與展望

高通量基因編輯技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景，與合成生物學(xué)相結(jié)合，可能再一次改變?nèi)祟惖纳钆c健康［40-41］。目前三種類型的多元基因編輯技術(shù)雖然已取得許多重要的進展，但都存在各自的缺陷，影響其進一步高通量化的發(fā)展。迭代的方法可以實現(xiàn)多元基因敲除、基因編輯和短片段的基因敲入，但由于需要多輪的基因編輯，因此耗費時間較長，且受體基因組容易產(chǎn)生背景突變。開發(fā)和應(yīng)用新基因編輯工具是推動高效的多元基因編輯技術(shù)發(fā)展的根本動力，目前的CRISPR-Cas9技術(shù)雖然催化基因編輯的效率很高，可以實現(xiàn)對微生物的高效基因敲除與基因編輯，但由于其對部分微生物的致死性，難以成為廣譜性的微生物多元基因編輯技術(shù)，且CRISPR-Cas9技術(shù)并不能做到對任意位置的基因組進行編輯?；诖笃蜠NA合成組裝的多元基因編輯可以實現(xiàn)多元基因敲入。目前受限于DNA合成的準(zhǔn)確性及對基因組結(jié)構(gòu)認識的不完整，幾個堿基的合成錯誤就可能導(dǎo)致細胞無法正常生存，因此現(xiàn)階段的技術(shù)還無法做到全基因組的合成，只能合成部分大片段然后組裝到基因組上。

若想要進一步實現(xiàn)高通量基因編輯，則需要在兩方面取得突破性進展。一方面要有新的高效的基因編輯工具出現(xiàn)，這種新技術(shù)需要能做到90%以上的基因編輯效率，不影響宿主細胞的基因修復(fù)系統(tǒng)，且可以實現(xiàn)多種類型的基因編輯。另一方面，高效的基因編輯工具通常以外源核酸片段指導(dǎo)靶向性，因此需要開發(fā)高效的多元核酸片段連鎖轉(zhuǎn)化方法。例如將所有的核酸片段包裹在囊泡中，然后與去壁的細菌細胞進行融合；或者將核酸片段整合到一個質(zhì)粒上，然后用CRISPR/Cas9等核酸酶切割產(chǎn)生線性片段。隨著DNA合成技術(shù)的不斷發(fā)展，以及人類對生物基因組結(jié)構(gòu)認識的不斷深入，全基因組合成也可能會逐步成為合成生物學(xué)中常用的技術(shù)。如果將高通量基因編輯技術(shù)稱為第二代基因編輯技術(shù)，類比基因測序技術(shù)的發(fā)展歷程，全基因組合成可能稱為第三代基因編輯技術(shù)。

［1］任向楠, 丁鋼強, 彭茂祥, 等. 大數(shù)據(jù)與營養(yǎng)健康研究［J］. 營養(yǎng)學(xué)報, 2017, 39（1）：5-9.

［2］杜玲, 劉剛, 陸健, 等. 高通量測序技術(shù)的發(fā)展及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用. ［J］. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, 2014（（12））：109-116.

［3］郭明璋, 許文濤. 基于高通量測序技術(shù)的細菌非編碼 研究方法進展［J］. 生物技術(shù)通報, 2015, 31（4）：99-104.

［4］李東萍, 郭明璋, 許文濤. 測序技術(shù)在腸道微生物中的應(yīng)用研究進展［J］. 生物技術(shù)通報, 2015, 31（2）：71-77.

［5］Boeke JD, Church G, Hessel A, et al. The genome projectwrite［J］. Science, 2016, 353（6295）：126-127.

［6］Swerdlow H, Wu S, Harke H, et al. Capillary gel electrophoresis for DNA sequencing：laser-induced fluorescence detection with the sheath flow cuvette［J］. Journal of Chromatography A, 1990, 516（1）：61-67.

［7］Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution［J］. Nature, 2009,460（7257）：894-898.

［8］Amiram M, Haimovich AD, Fan C, et al. Evolution of translation machinery in recoded bacteria enables multi-site incorporation of nonstandard amino acids［J］. Nat Biotechnol, 2015, 33（12）：1272-1279.

［9］Sternberg N, Hamilton D. Bacteriophage P1 site-specific recombination：IRecombination between loxP sites［J］. Journal of Molecular Biology, 1981, 150（4）：467-486.

［10］Sternberg N. Bacteriophage P1 site-specific recombination：IIIStrand exchange during recombination at lox sites［J］. Journal of Molecular Biology, 1981, 150（4）：603-608.

［11］Cox MM. The FLP protein of the yeast 2-microns plasmid：expression of a eukaryotic genetic recombination system inEscherichia coli［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80（14）：4223-4227.

［12］Murphy KC. Use of bacteriophage λ recombination functions to promote gene replacement inEscherichia coli［J］. J Bacteriol,1998, 180（8）：2063-2071.

［13］Zhang Y, Buchholz F, Muyrers JPP, et al. A new logic for DNA engineering using recombination inEscherichia coli［J］. Nature Genetics, 1998, 20（2）：123-128.

［14］Ellis HM, Yu D, DiTizio T. High efficiency mutagenesis, repair,and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98（12）：6742-6746.

［15］Pines G, Freed EF, Winkler JD, et al. Bacterial recombineering：genome engineering via phage-based homologous recombination［J］. ACS Synthetic Biology, 2015, 4（11）：1176-1185.

［16］Beumer K, Bhattacharyya G, Bibikova M, et al. Efficient gene targeting in Drosophila with zinc-finger nucleases［J］. Genetics,2006, 172（4）：2391-2403

［17］Zu Y, Tong X, Wang Z, et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish［J］.Nature Methods, 2013, 10（4）：329-331.

［18］Jako?iūnas T, Jensen MK, Keasling JD. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories［J］. Metabolic Engineering,2016, 2016（（34））：44-59.

［19］Lambowitz AM, Zimmerly S. Group II introns：mobile ribozymes that invade DNA［J］. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2011, 3（8）：a003616-a003616.

［20］Chen Y, McClane BA, Fisher DJ, et al. Construction of an alpha toxin gene knockout mutant of Clostridium perfringens type A by use of a mobile group II intron［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71（11）：7542-7547.

［21］Gallagher RR, Li Z, Lewis A O, et al. Rapid editing and evolution of bacterial genomes using libraries of synthetic DNA［J］. Nature Protocols, 2014, 9（10）：2301-2316.

［22］Wang HH, Huang PY, Xu G, et al. Multiplexedin vivoHis-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis［J］. ACS Synthetic Biology, 2012, 1（2）：43-52.

［23］Isaacs FJ, Carr PA, Wang HH, et al. Precise manipulation of chromosomesin vivoenables genome-wide codon replacement［J］. Science, 2011, 333（6040）：348-353.

［24］Ma NJ, Moonan DW, Isaacs FJ. Precise manipulation of bacterial chromosomes by conjugative assembly genome engineering［J］.Nature Protocols, 2014, 9（10）：2285-2300.

［25］Wang HH, Kim H, Cong L, et al. Genome-scale promoter engineering by coselection MAGE［J］. Nature Methods, 2012, 9（6）：591-593.

［26］Carr PA, Wang HH, Sterling B, et al. Enhanced multiplex genome engineering through co-operative oligonucleotide co-selection［J］.Nucleic Acids Research, 2012, 40（17）：e132-e132.

［27］Nyerges á, Cs?rg? B, Nagy I, et al. A highly precise and portable genome engineering method allows comparison of mutational effects across bacterial species［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113（9）：2502-2507.

［28］Dalia AB, McDonough EK, Camilli A. Multiplex genome editing by natural transformation［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111（24）：8937-8942.

［29］Warner JR, Reeder PJ, Karimpour-Fard A, et al. Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides［J］. Nat Biotechnol, 2010, 28（8）：856-862.

［30］Sandoval NR, Kim JYH, Glebes TY, et al. Strategy for directing combinatorial genome engineering inEscherichia coli［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109（26）：10540-10545.

［31］Jiang W, Bikard D, Cox D, et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems［J］. Nat Biotechnol, 2013,31（3）：233-239.

［32］Standage-Beier K, Zhang Q, Wang X. Targeted large-scale deletion of bacterial genomes using CRISPR-nickases［J］. ACS Synthetic Biology, 2015, 4（11）：1217-1225.

［33］Ronda C, Pedersen LE, Sommer MOA, et al. CRMAGE：CRISPR optimized mage recombineering［J］. Sci Rep, 2016, 6（19452）：1-11.

［34］Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPRCas systems［J］. Science, 2013, 339（6121）：819-823.

［35］Esvelt KM, Mali P, Braff JL, et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing［J］. Nature Methods,2013, 10（11）：1116-1121.

［36］Krishnakumar R, Grose C, Haft DH, et al. Simultaneous noncontiguous deletions using large synthetic DNA and site-specific recombinases［J］. Nucleic Acids Research, 2014, 42（14）：e111-e111.

［37］Pósfai G, Plunkett G, Fehér T, et al. Emergent properties of reduced-genomeEscherichia coli［J］. Science, 2006, 312（5776）：1044-1046.

［38］Borrel G, McCann A, Deane J, et al. Genomics and metagenomics of trimethylamine-utilizing Archaea in the human gut microbiome［J］. The ISME Journal, 2017, 2017（（11））：2059-2074.

［39］Ostrov N, Landon M, Guell M, et al. Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome［J］. Science, 2016, 353（6301）：819-822.

［40］劉奪, 杜瑾, 趙廣榮, 等. 合成生物學(xué)在醫(yī)藥及能源領(lǐng)域的應(yīng)用［J］. 化工學(xué)報 , 2011, 62（9）：2391-2397.

［41］杜若曦, 郭明璋, 謝子鑫, 等. 合成生物學(xué)在改善腸道健康狀態(tài)中的應(yīng)用與展望［J］. 生物技術(shù)通報, 2018, 34（1）：49-59.