邱子豪，胡學遠，馮秀晶，趙 元，宋曼玉，王超然，劉 濤，范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030)

研究證實，快速生長發(fā)育期間，大腦特別容易受到外界因素的損傷，在此期間單次或多次暴露于麻醉藥能夠顯著引起大腦廣泛的神經(jīng)元凋亡(apoptosis)，并伴隨腦功能的長期性損害[1]。2013年，在英國麻醉學雜志舉辦研討會上專家也曾就麻醉神經(jīng)毒性進行了深入的探討，并指出機體暴露于麻醉藥的時期(年齡，時長)和暴露于麻醉藥的深度(包括次數(shù)和劑量)，是造成快速生長發(fā)育期神經(jīng)毒性的重要因素[2]。細胞自噬(autophagy)是指某些需降解的蛋白質(zhì)或細胞器等細胞質(zhì)成分被包裹，并最終被運送至溶酶體進行降解的過程。在正常情況下，自噬的主要作用是對受損細胞器進行降解，從而促進細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用，是細胞為了適應內(nèi)、外界環(huán)境變化的一種自我保護反應[3]。相關(guān)的研究還發(fā)現(xiàn)，在某些相同因素誘導下，細胞自噬和細胞凋亡可先后出現(xiàn)或同時存在于同一細胞中，表現(xiàn)的作用是相互促進或互相拮抗[4]。在病理狀態(tài)早期，自噬起到的是保護作用，能及時清除受損的細胞器和蛋白以促進物質(zhì)、能量的循環(huán)利用及維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[5]；而到病理狀態(tài)晚期，自噬已不能逆轉(zhuǎn)細胞死亡時，細胞器被大量降解必然導致自噬性細胞死亡[6]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，多次注射低劑量氯胺酮可以引起成年SD大鼠海馬發(fā)生自噬，并指出自噬的增強是對氯胺酮毒性作用的保護性反應[7]，提示全麻藥物可引起海馬神經(jīng)元自噬，且自噬的發(fā)生可能是種保護作用。另有研究表明，骨骼肌細胞暴露于全身麻醉藥巴比妥鈉或異氟醚后均可以引起自噬水平的增強；且在相同時長下，麻醉藥濃度越高越容易引起自噬[8]。還有學者指出，20月齡的老齡SD大鼠，在經(jīng)歷1.5%異氟醚麻醉4 h后，可以顯著性引起海馬LC3-II/I表達增加，同時水迷宮測試提示學習能力下降，表明異氟醚引起的細胞自噬可能具有一定的毒性作用[9]。因此，自噬在麻醉過程中究竟起到何種作用還有待進一步研究。因此，本試驗通過建立異氟醚麻醉模型，探討不同時間異氟醚麻醉對幼齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7日齡SD幼鼠(P7)40只，總共4窩，每窩10只，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要藥物與試劑

異氟醚購自深圳瑞沃德有限公司；戊巴比妥鈉購自Sigma(St. Louis, MO)；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Caspase-3、LC3 A/B及Beclin-1抗體購自Cell Signaling Technology公司；Bcl-2、β-actin、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)抗體及SV超敏兩步法組化試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司；Western及IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒等購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 模型建立和樣品采集 40只P7幼鼠隨機分為對照組和1.5%異氟醚麻醉2、3、4、6 h組(n=8)，建立試驗模型。將大鼠置于自制透明麻醉箱內(nèi)，使用加熱墊保持盒內(nèi)溫度在37 ℃左右，以60%空氧混合氣體作為載體給大鼠吸入1.5%的異氟醚。對照組不進行麻醉處理，其他操作步驟與各異氟醚麻醉組相同。使用氣體監(jiān)護儀監(jiān)測麻醉箱內(nèi)麻醉氣體以及氧氣的濃度。幼鼠分別于麻醉相應時間點后腹腔注射150 mg·kg-1戊巴比妥鈉處死。安樂死后每組取3只幼鼠用4%多聚甲醛進行心臟灌流，然后取腦，再浸入4%多聚甲醛(pH=7.4)固定，用于石蠟包埋；其余5只迅速取出腦組織，并置于冰盤上用4 ℃中性PBS進行沖洗，分離海馬組織，取出后立即放入1.5 mL EP管，并置于液氮迅速冷凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 TUNEL染色 1)組織固定后，進行常規(guī)脫水及浸蠟，然后進行切片，厚度4～6 μm，常規(guī)脫蠟、水合。2)按試劑盒說明書分別將切片浸入蛋白酶K工作液、3% H2O2封閉液、TdT酶反應液和Streptavidin-HRP工作液，按要求孵育并漂洗。3)隨機選2張切片，作為對照，陽性對照滴加蛋白酶K工作液后加100 μL DNase I反應液；陰性對照不加TdT酶反應液；4)滴加DAB工作液，室溫顯色，鏡下控制反應時間，30 s～10 min；PBS中終止反應，最后用蘇木素染液復染，光學顯微鏡下在同一參數(shù)下拍照觀察，每一張切片隨機選取8個(CA1、CA2、CA3和DG區(qū)各2個)高倍視野(400×)。

1.3.3 LC3-II免疫組化 1)組織固定后，進行常規(guī)脫水及浸蠟，然后進行切片，厚度4～6 μm；2)切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合后用3% H2O2(現(xiàn)配現(xiàn)用)室溫孵育10 min；3)切片浸入0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液，進行高壓熱修復抗原4 min；4) 切片經(jīng)5% BSA封閉20 min后，滴加LC3 B抗體(1∶400)濕盒中4 ℃孵育過夜；5)樣本漂洗后滴加聚合HRP標記抗兔IgG室溫孵育30 min；6)DAB顯色，室溫鏡下控制反應時間(5～10 min)，然后用PBS終止顯色，然后用蘇木素染液復染；光學顯微鏡下在同一參數(shù)下拍照觀察，每一張切片隨機選取8個(CA1、CA2、CA3和DG區(qū)各2個)高倍視野(400×)。

1.3.4 Western blot分析 1)海馬組織加入適量Western及IP細胞裂解液充分裂解，于4 ℃離心機12 000 g離心10 min，取上清；2)采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測所分離上清液蛋白濃度；3)參照總蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液和稀釋液后，將樣品總質(zhì)量濃度確定為3 μg·μL-1，煮沸10 min，-80 ℃凍存樣品備用；4)按照SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明，分別配制分離膠和濃縮膠，進行電泳；5)低溫條件下恒流300 mA進行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；6)將轉(zhuǎn)完膜的PVDF膜放入5%脫脂奶粉-TBST封閉液中，37 ℃恒溫搖床封閉90 min；7)用5%脫脂奶粉-TBST分別按β-actin 1∶600，Cleaved-caspase-3 1∶1 000，Bcl-2 1∶500，LC3-II/I 1∶1 200和Beclin-1 1∶800的比例稀釋一抗，混勻，4 ℃孵育過夜；8)分別按β-actin 1∶8 000，Cleaved-caspase-3 1∶4 000，Bcl-2 1∶5 000，LC3-II/I 1∶6 000和Beclin-1 1∶8 000的比例稀釋二抗，37 ℃搖床孵育1.5 h；9)用ECL法對PVDF膜進行目的蛋白發(fā)光檢測，用Tanon 5200全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，獲取曝光結(jié)果，Gel-Pro analyzer軟件對蛋白質(zhì)條帶進行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 海馬組織TUNEL染色

不同組別麻醉各時間點海馬CA1區(qū)TUNEL染色結(jié)果(圖1)，光鏡下陽性細胞顯示核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈棕黃色或黃褐色，而陰性細胞則成淡藍色。在麻醉2 h時，可見少量黃褐色深染細胞核，3、4和6 h時陽性細胞逐漸增多，且在4和6 h時海馬錐體細胞排列松散，紊亂，說明海馬區(qū)損傷較為嚴重。

圖1 麻醉各時間點海馬CA1區(qū)TUNEL染色結(jié)果Fig.1 Results of TUNEL-staining at each anesthesia time point in hippocampus CA1 area

2.2 海馬組織 LC3-II免疫組化染色

從圖2可見，不同組別麻醉各時間點LC3-II表達結(jié)果，陽性細胞在光鏡下呈棕黃色或黃褐色，而陰性細胞則呈淡藍色。免疫組化結(jié)果顯示，在麻醉2 h時間點，可見少量黃褐色細胞核深染，3 h時陽性細胞比例最高。

圖2 麻醉各時間點海馬CA1區(qū)LC3-II免疫組化結(jié)果Fig.2 Results of LC3-II immunostaining at each anesthesia time point in hippocampus CA1 area

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Bcl-2的相對表達情況

由圖3可知：隨著異氟醚作用時間的增加，Caspase-3 表達逐漸增強；與對照組比較，3、4和6 h組Caspase-3 表達增強明顯，差異顯著(P<0.05)；與2、3 h組比較，6 h組Caspase-3 表達增強明顯，差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知：隨著異氟醚作用時間的增加，Bcl-2表達量隨著麻醉時間的延長逐漸下降，其中在3、4和6 h時與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.4 自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I及Beclin-1的相對表達情況

隨著異氟醚作用時間的增加，LC3-II/I表達量先升高后下降；與對照組比較，3 h組LC3-II/I表達增強明顯，差異顯著(P<0.05)；與2 h組比較，3 h 組LC3-II/I表達增強明顯，差異顯著(P<0.05)；與3 h組比較，4和6 h組LC3-II/I表達減少明顯，差異顯著(P<0.05)(圖5)。

與對照組比較，*. P<0.05；與其他麻醉組比較，#. P<0.05。下同Compared with the control group, *. P<0.05; Compared with other anesthesia group, #.P<0.05. The same as below圖3 Caspase-3在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的表達量Fig.3 Expression of cleaved-Caspase-3 in hippocampus of young rats

圖4 Bcl-2在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的表達量Fig.4 Expression of Bcl-2 in hippocampus of young rats

圖5 LC3-II/I在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的表達量Fig.5 Expression of LC3-II/I in hippocampus of young rats

由圖6可見：隨著異氟醚作用時間的增加，Beclin-1表達量先上升后下降；與對照組比較，2、3和4 h組Beclin-1表達增強明顯，差異顯著(P<0.05)；與2、3和4 h組比較，6 h組Beclin-1表達減少明顯，差異顯著(P<0.05)。

圖6 Beclin-1在幼齡大鼠海馬神經(jīng)元中的相對表達量Fig.6 Expression of Beclin-1 in hippocampus of young rats

3 討 論

近年來關(guān)于全麻藥能誘導腦神經(jīng)元凋亡，同時伴隨腦功能的長期性損害受到了世界各國的廣泛關(guān)注[10-12]。Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的抗凋亡基因，它具有抑制凋亡的作用[13]。Caspase-3是細胞凋亡途徑的最后效應子，能夠?qū)е录毎蛲鯷14]。腦內(nèi)的海馬組織是參與學習或記憶神經(jīng)回路的重要部分。學習記憶的系統(tǒng)中任何環(huán)節(jié)的缺陷都可能損害記憶功能。本試驗通過P7幼鼠建立臨床常用濃度的異氟醚麻醉模型來檢測麻醉藥對海馬神經(jīng)元的毒性作用。試驗結(jié)果表明，隨著異氟醚作用時間的增加，與對照組相比，活化的Caspase-3表達量逐漸增加；Bcl-2隨著麻醉時間的延長逐漸下降。這表明異氟醚能誘導幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，并隨著麻醉時間的加長凋亡水平逐漸升高，這與前人的研究結(jié)果類似[15]。

研究認為自噬在細胞營養(yǎng)缺乏，或者應激條件存在時有效地保護了細胞，實現(xiàn)了細胞的自體穩(wěn)態(tài)。LC3和Beclin-1是自噬的特定生物化學標記，正常細胞中LC3-I和LC3-II均能被發(fā)現(xiàn)，當自噬發(fā)生時，LC3-I會向LC3-II轉(zhuǎn)化，而使LC3-II表達升高并牢牢固定在自噬體膜上。一旦自噬體與溶酶體發(fā)生融合，自噬體膜上的LC3-II就會被溶酶體水解酶降解，因此LC3-II的表達量可以反映自噬形成和降解之間的平衡關(guān)系。因此，通過檢測LC3-II/I、Beclin-1 含量變化可判斷自噬活動的強度[16]。本研究結(jié)果顯示，隨著異氟醚作用時間的增加，與對照組相比，LC3-II/I表達含量先升高后下降，并且在異氟醚作用3 h時表達含量明顯升高；Beclin-1表達含量也是先升高后下降，在異氟醚作用2、3和4 h時含量明顯升高，并且在3 h時升高最明顯。說明在異氟醚的作用下，幼齡SD大鼠海馬神經(jīng)元伴隨著自噬的激活。綜合LC3和Beclin-1的表達結(jié)果來看，異氟醚麻醉2～4 h后自噬水平顯著提高，其中麻醉3 h自噬水平最高，然后隨著麻醉時間的延長自噬水平逐漸減弱。但也有研究表明PD7幼齡大鼠接受1.5%異氟醚麻醉6 h不會引起大腦皮層Beclin-1的表達升高[17]。而成年小鼠接受1%異氟醚麻醉3 h可以引起成年小鼠皮層顯著自噬，但不會引起海馬區(qū)自噬的顯著增強[18]。這種與本試驗不一致的結(jié)果，可能與麻醉濃度的選擇有關(guān)，也可能與幼齡大鼠在麻醉過程中不同腦區(qū)對麻醉敏感程度不同有關(guān)。

自噬和凋亡可先后出現(xiàn)或同時存在，表現(xiàn)出相互促進或互相拮抗的作用，并且自噬和凋亡的因子存在著相互影響和交叉。適度的自噬能保護細胞免受損傷，而過度的自噬又將加速細胞死亡，所以自噬的調(diào)控可能對細胞產(chǎn)生不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在酒精致PC12細胞損傷過程中，其自噬受到了抑制，Caspase-3 表達含量升高，而激活自噬則相反。S. Y. Hung等[19]研究指出，增強自噬能抑制Aβ誘導的細胞死亡，增加海馬神經(jīng)元的存活。秀麗隱桿線蟲發(fā)育過程中，Beclin-1下調(diào)引起了Caspase-3依賴的凋亡增加和凋亡細胞數(shù)目增多[20]。在一些重金屬中毒或缺血缺氧模型中，也發(fā)現(xiàn)適當?shù)淖允煽蓪ι窠?jīng)元產(chǎn)生保護作用[21]。近年來，有關(guān)麻醉藥對自噬的調(diào)節(jié)也陸續(xù)被報道[22]，且不同的試驗結(jié)果也有一定差異，并且不同異氟醚麻醉時間點對自噬及凋亡的影響及自噬在其中發(fā)揮著怎樣的作用還不明確。本研究結(jié)果顯示，隨著異氟醚作用時間的增加，與對照組相比，Beclin-1在2、3 h表達含量明顯升高，而Bcl-2表達含量逐漸降低；與幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元在異氟醚作用3、4 h相比，在6 h時Beclin-1表達含量明顯下降，而Caspase-3表達含量明顯升高。通過結(jié)果推斷，異氟醚能夠誘發(fā)幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元自噬的活化，進而起到抑制凋亡的作用；而異氟醚引起的自噬不能逆轉(zhuǎn)異氟醚導致的海馬神經(jīng)元凋亡，或過高凋亡抑制幼年SD大鼠海馬神經(jīng)元自噬的活化，而使神經(jīng)元最終凋亡。

4 結(jié) 論

異氟醚不僅可以引起幼齡SD大鼠海馬神經(jīng)元廣泛凋亡，而且還能誘導海馬神經(jīng)元自噬，但凋亡水平隨麻醉時間延長逐漸加強，而自噬水平先升高后降低。自噬在異氟醚誘導的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡中可能發(fā)揮著保護性作用。

參考文獻(References)：

[1] 張建峰, 馬 莉. 全麻藥對幼齡動物腦神經(jīng)細胞凋亡的影響[J]. 國際麻醉學與復蘇雜志, 2013, 34(2): 171-176.

ZHANG J F, MA L. Effects of general anesthetics on neuroapoptosis in infant animal’s brain[J].InternationalJournalofAnesthesiologyandResuscitation, 2013, 34(2): 171-176. (in Chinese)

[2] JEVTOVIC-TODOROVIC V, ABSALOM A R, BLOMGREN K, et al. Anaesthetic neurotoxicity and neuroplasticity: An expert group report and statement based on the BJA Salzburg Seminar[J].BrJAnaesth, 2013, 111(2): 143-151.

[3] YANG Z F, KLIONSKY D J. Eaten alive: A history of macroautophagy[J].NatCellBiol, 2010, 12(9): 814-822.

[4] XUE L Z, FLETCHER G C, TOLKOVSKY A M. Autophagy is activated by apoptotic signalling in sympathetic neurons: An alternative mechanism of death execution[J].MolCellNeurosci, 1999, 14(3): 180-198.

[5] ZHAO D X, YUAN H P, YI F, et al. Autophagy prevents doxorubicin-induced apoptosis in osteosarcoma[J].MolMedRep, 2014, 9(5): 1975-1981.

[6] JIANG Q, LI F, SHI K J, et al. ATF4 activation by the p38MAPK-eIF4E axis mediates apoptosis and autophagy induced by selenite in Jurkat cells[J].FEBSLett, 2013, 587(15): 2420-2429.

[7] 張 陽, 曹甲甲, 陸俊龍, 等. 腹腔連續(xù)注射低劑量氯胺酮后大鼠海馬LC3和Beclin1的表達[J]. 中國法醫(yī)學雜志, 2012, 27(2): 101-104.

ZHANG Y, CAO J J, LU J L, et al. Expression of LC3 and Beclin1 in rat hippocampus after repeated intraperitoneal administration of low dose of ketamine[J].ChineseJournalofForensicMedicine, 2012, 27(2): 101-104. (in Chinese)

[8] KASHIWAGI A, HOSOKAWA S, MAEYAMA Y, et al. Anesthesia with disuse leads to autophagy upregulation in the skeletal muscle[J].Anesthesiology, 2014, 122(5): 1075-1083.

[9] LI Z Q, LI L X, MO N, et al. Duration-dependent regulation of autophagy by isoflurane exposure in aged rats[J].NeurosciBull, 2015, 31(4): 505-513.

[10] 滕清宇, 李瑋偉, 袁紅斌, 等. 全麻藥發(fā)育期神經(jīng)毒性機制的研究進展[J]. 臨床麻醉學雜志, 2016, 32(9): 929-931.

TENG Q Y, LI W W, YUAN H B, et al. The research progress of neurotoxic mechanism in the development of total anesthetic[J].JournalofClinicalAnesthesiology, 2016, 32(9): 929-931. (in Chinese)

[11] 裴愛月. 海藻糖對異氟醚誘導轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬氧化應激損傷的影響[D]. 長春: 吉林大學, 2016.

PEI A Y. Impact of trehalose on hippocampal oxidative stress injury induced by lsoflurane in APP Trangenic mice[D]. Changchun: Jilin University, 2016. (in Chinese)

[12] WANG Q, SHEN F Y, ZOU R, et al. Ketamine-induced apoptosis in the mouse cerebral cortex follows similar characteristic of physiological apoptosis and can be regulated by neuronal activity[J].MolBrain, 2017, 10: 24.

[13] 劇世強, 郭慧利, 王利勤, 等. 豬體細胞克隆胚胎體外發(fā)育過程中的凋亡規(guī)律[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2010, 41(6): 678-684.

JU S Q, GUO H L, WANG L Q, et al. Apoptotic law of porcine cloned embryos during developmentinvitro[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2010, 41(6): 678-684. (in Chinese)

[14] 楊 申. P38MAPK抑制劑對血管性癡呆大鼠海馬細胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表達及其學習記憶能力的影響[D]. 濟南: 山東大學, 2013.

YANG S. The effect of P38MAPK inhibitor on hippocampus cells apoptosis BCL-2,Caspase-3 and learning memory ability in vascular dementia rat[D]. Jinan: Shandong University, 2013. (in Chinese)

[15] PENG J, DROBISH J K, LIANG G, et al. Anesthetic preconditioning inhibits isoflurane-mediated apoptosis in the developing rat brain[J].AnesthAnalg, 2014, 119(4): 939-946.

[16] 康 愷, 林 鷙, 高?；? 等. 豬瘟病毒促進細胞自噬并利于病毒增殖[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2014, 45(9): 1481-1487.

KANG K, LIN Z, GAO H H, et al. Classical swine fever virus promotes cell autophagy which facilitates virus proliferation[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2014, 45(9): 1481-1487. (in Chinese)

[17] XIONG J W, KONG Q Y, DAI L Y, et al. Autophagy activated by tuberin/mTOR/p70S6K suppression is a protective mechanism against local anaesthetics neurotoxicity[J].JCellMolMed, 2017, 21(3): 579-587.

[18] SHENG R, ZHANG T T, FELICE V D, et al. Preconditioning stimuli induce autophagy via sphingosine kinase 2 in mouse cortical neurons[J].JBiolChem, 2014, 289(30): 20845-20857.

[19] HUNG S Y, HUANG W P, LIOU H C, et al. Autophagy protects neuron from Aβ-induced cytotoxicity[J].Autophagy, 2009, 5(4): 502-510.

[20] TAKACS-VELLAI K, VELLAI T, PUOTI A, et al. Inactivation of the autophagy genebec-1 triggers apoptotic cell death inC.elegans[J].CurrBiol, 2005, 15(16): 1513-1517.

[21] 邵明玉. 自噬誘導劑海藻糖對鉛暴露幼鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用[D]. 長春: 吉林大學, 2013.

SHAO M Y. Protective role of an autophagic inducer trehalvse on hippocampal neurons damaged by lead exposure in young rats[D]. Changchun: Jilin University, 2013. (in Chinese)

[22] 張彤彤. 鞘氨醇激酶-2在原代鼠皮層神經(jīng)元激活自噬介導缺血耐受[D]. 蘇州: 蘇州大學, 2015.

ZHANG T T. Sphingosine kinase-2 induced autophagy activation mediates ischemic tolerance in primary cortical neurons[D]. Suzhou: Suzhou University, 2015. (in Chinese)