韓克光，申勇濤，原 愷，范 華，陳 靜，金淑秀，古少鵬，田文霞，張 鼎，霍乃蕊*,常 泓

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗中心，太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，太谷 030801)

受集約化養(yǎng)殖過程中飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方式、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用以及飼料質(zhì)量等問題的影響，骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)引起的動物健康和動物福利問題廣受關(guān)注[1-3]。OP是一種常見的骨代謝疾病，以骨脆性增加、骨量減少、微觀結(jié)構(gòu)退化、高骨轉(zhuǎn)換、破骨細胞(osteoclasts,OC)形成和骨吸收活性異常增加為特征[4-7]。OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)是OC形成過程中的一個重要信號通路[8-10]，是骨骼生理研究領(lǐng)域的一個重大進展[8]。該系統(tǒng)包括核因子-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB, RANK)，核因子κB受體活化因子配體(receptor activated nuclear factor kappa B ligand, RANKL) 和骨保護素(osteoprotegerin，orthopantomography, OPG)。多種因素通過OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)引起骨量丟失，導(dǎo)致OP發(fā)生[11]，許多細胞因子也通過該系統(tǒng)發(fā)揮對骨代謝的調(diào)節(jié)作用[12]。鑒于其在OP發(fā)生機制中的重要作用，該信號系統(tǒng)成為治療OP藥物設(shè)計的新靶點[3]。

課題組前期研究結(jié)果表明以羊骨膠原肽(sheep bone collagen peptide,SBCP)和氯化鈣為原料制備的鈣螯合羊骨膠原多肽(SBCP-Ca)對去卵巢大鼠的骨質(zhì)改善效果比雌激素更為安全和有效[13]，為進一步了解SBCP-Ca防治OP的作用機制，本研究建立OP動物模型，探討SBCP-Ca對OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的影響，為骨破壞性疾病治療藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

SBCP-Ca由本實驗室以羊骨膠原肽和氯化鈣為原料制備[14]。Trizol(Life公司)、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和SYBRTMPremix ExTaqTMⅡ為TaKaRa產(chǎn)品；大鼠血清Ⅰ型前膠原氨基端前肽(procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide, PINP)和Ⅰ型膠原羧基端肽(C-terminal cross-linking telopeptide of type Ⅰ collagen, β-CTx)ELISA試劑盒購自Elabscience Biotechnology有限公司；原子吸收光譜儀(AA7020，北京東西分析儀器有限公司)；SpectraMax M5多功能酶標儀(Molecular Devices)；掃描電子顯微鏡(JEOL JEM-6490LV，日本電子光學(xué)實驗室)；熒光定量PCR儀(Mx 3005PTM, 美國Stratagene)等。

1.2 實驗動物

10周齡雌性未孕SD大鼠和嚙齒類動物標準顆粒飼料均由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[SCXK(晉) 2015-0001]提供，大鼠體重(203±20) g，自由飲水，環(huán)境條件符合GB14923-2001要求，適應(yīng)性飼喂2周后，模型組和SBCP-Ca組大鼠以10%水合氯醛進行麻醉(4 mL·kg-1，腹腔注射)，背部去毛區(qū)(3 cm×5 cm)經(jīng)聚維酮碘消毒后，再用75%酒精脫碘，再沿背中線向下做長2～3 cm的縱行切口，暴露卵巢及與其緊密相連的子宮角，結(jié)扎子宮角并將其切斷，摘除雙側(cè)卵巢，縫合背部肌肉及皮膚。假手術(shù)組的手術(shù)過程同上，但不切除卵巢組織。術(shù)后連續(xù)5 d肌注青霉素以防感染，康復(fù)1周后，分組試驗(n=8)。SBCP-Ca組以100 mg·mL-1的SBCP-Ca連續(xù)灌胃8周，劑量為10 mL·(kg·d)-1，假手術(shù)組和模型組灌服同體積蒸餾水，8 周后斷食12 h，乙醚淺麻醉，摘除眼球眼眶取血，脫頸處死大鼠，采集股骨樣本。血樣經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，收集并分裝血清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清PINP和β-CTx 的測定

大鼠血清PINP和β-CTx含量按照ELISA試劑盒所描述的夾心ELISA和競爭ELISA法測定。

1.4 骨鈣和羥脯氨酸含量的測定

大鼠股骨在液氮中研磨成粉，風干至恒重，準確稱取并置于瓷坩堝中，馬弗爐300 ℃預(yù)灰化1 h，550 ℃繼續(xù)灰化3 h，關(guān)掉電源，待溫度降至110 ℃以下，取出坩堝，樣品若有黑色，則加1～2滴硝酸繼續(xù)消化1 h，直至出現(xiàn)白色結(jié)晶。將灰分用2 mL鹽酸(1∶5)溶解，再加入18 mL去離子水混勻，取4 mL用去離子水定容至50 mL，再取定容好的溶液10 mL，加5%氯化鍶溶液0.2 mL，用原子吸收光譜儀測定鈣含量。羥脯氨酸按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明操作測定。

1.5 骨微觀結(jié)構(gòu)觀察

大鼠左側(cè)股骨經(jīng)戊二醛固定和EDTA脫鈣處理后，取股骨遠端干骺端橫切面制作切片，進行掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)分析。

1.6 qRT-PCR

Trizol法提取各組大鼠右側(cè)股骨總RNA[15]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性并測定濃度。cDNA合成參照文獻進行[16]。根據(jù)SYBRTMPremix ExTaqTMⅡ試劑盒說明進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系(10 μL):SYBRTMPremix ExTaqTMⅡ(2×)5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.2 μL，模板100 ng，補充ddH2O至10 μL。設(shè)置程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 30 s，延伸60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s[17]，45個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，用擴增曲線的Ct值計算定量結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計算RANK、RANKL、OPG在各組大鼠股骨中的相對表達水平[18]。引物參照NCBI上已公開發(fā)表的序列進行設(shè)計并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.7 測序分析

熒光定量PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結(jié)果與各基因的標準序列進行比對，驗證PCR擴增產(chǎn)物是否為對應(yīng)的目的基因片段。

1.8 統(tǒng)計方法

表1 qRT-PCR引物及預(yù)期產(chǎn)物大小Table 1 Primers and the expected sizes of PCR product

2 結(jié) 果

2.1 OP模型的建立

由表2可知，模型組的PINP水平和β-CTx水平均極顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，說明骨轉(zhuǎn)換加快，成骨活性和破骨活性均增強，符合骨質(zhì)疏松的特點。模型組鈣和羥脯氨酸的含量均極顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)，說明模型組骨質(zhì)流失嚴重。SEM觀察結(jié)果顯示假手術(shù)組(圖1A)骨髓腔面積較小，骨小梁(trabecular bone，TB)結(jié)構(gòu)清晰，排列緊密，粗而延續(xù)，骨質(zhì)致密。而模型組(圖1B)TB變得薄而斷續(xù)，TB間距變寬，骨髓腔變得大而空洞，細胞很少，骨質(zhì)變得疏松。以上結(jié)果表明本研究OP造模成功。

2.2 SBCP-Ca對去卵巢大鼠骨骼指標的影響

表2顯示，去卵巢大鼠灌服SBCP-Ca后，PINP與β-CTx水平極顯著低于模型組(P<0.01)，并且與假手術(shù)組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明骨轉(zhuǎn)換正常；鈣與羥脯氨酸含量均極顯著高于模型組(P<0.01)，且鈣含量還極顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，說明SBCP-Ca可防止骨質(zhì)流失并可促進鈣鹽在骨的沉積而增加骨的硬度。

表2 SBCP-Ca對去卵巢大鼠血清 PINP、β-CTx 水平及骨組織鈣和羥脯氨酸含量的影響Table 2 Effects of SBCP-Ca on the level of PINP, β-CTx in serum and the content of Ca and hydroxyproline in bone of ovariectomized

右上角大寫字母和小寫字母分別代表0.01水平和0.05水平差異顯著，同列數(shù)據(jù)右上角所標字母相異表示差異顯著，相同表示差異不顯著，下同
a, b, c represent significant level α=0.05; A, B, C represent extremely significant level α=0.01. Different letters in the same column indicate statistic differences between the treatments, same letters mean no significant differences between treatments. The same as below

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.SBCP-Ca組；TB為骨小梁；BM為骨髓腔A. Sham group; B. Model group; C.SBCP-Ca group; TB represents bone trabecula; BM represents bone marrow圖1 各組大鼠股骨遠端干骺端掃描電鏡觀察Fig.1 SEM observation for metaphysis of distal femur by different treatments

2.3 SBCP-Ca對去卵巢大鼠骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

SBCP-Ca組(圖1C)骨小梁排列較為緊湊，連續(xù)性好，與模型組相比，大為改善，骨髓腔內(nèi)充滿細胞，說明SBCP-Ca可防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生，具有改善骨質(zhì)的作用。

2.4 SBCP-Ca對去卵巢大鼠RANK、RANKL和OPG轉(zhuǎn)錄的影響

由圖2可知，RANK和RANKL的相對轉(zhuǎn)錄量在模型組和假手術(shù)組之間差異極顯著(P<0.01)，說明在骨質(zhì)疏松骨中，受體RANK在OC及OC前體細胞中的相對轉(zhuǎn)錄量極顯著升高，是假手術(shù)組的73.19倍；由骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞(osteoblasts, OB)表達的RANKL在模型組的相對表達量也極顯著升高，是假手術(shù)組的38.68倍。上調(diào)表達的RANK和RANKL使更多的OC成熟，抑制OC凋亡，并增強OC的骨吸收活性，因此引發(fā)骨質(zhì)疏松。圖2中，模型組的OPG轉(zhuǎn)錄水平與假手術(shù)組差異不顯著(P>0.05)，說明卵巢切除和骨質(zhì)疏松并不影響OB分泌OPG的能力。SBCP-Ca組的RANK和RANKL的相對轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于模型組(P<0.01)，說明SBCP-Ca對OC的形成和骨吸收活性有顯著抑制作用。SBCP-Ca組的OPG相對轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于模型組和假手術(shù)組(P<0.01)，是假手術(shù)組的1.62 倍，模型組的1.74倍，說明SBCP-Ca還可促進去卵巢大鼠OB分泌超過正常水平的OPG，從而阻斷骨吸收，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

圖3中，模型組的RANKL/OPG比值是假手術(shù)組的41.71倍，差異極顯著(P<0.01)，而SBCP-Ca組的RANKL/OPG比值極顯著低于模型組(P<0.01)，且和假手術(shù)組差異不顯著(P>0.05)。

2%瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖4)，熒光定量PCR產(chǎn)物的大小與預(yù)期一致，分別為100(RANK)、134(RANKL)、83(OPG)、114(β-actin)bp。對測序結(jié)果與各基因的標準序列進行比對，RANK和RANKL

圖2 各組大鼠股骨組織中RANK、RANKL和OPG的mRNA轉(zhuǎn)錄情況Fig.2 Relative expression level of RANK, RANKL and OPG mRNA in rat femur by different treatment

各有一個堿基的差異，OPG序列100%吻合，說明本研究所設(shè)計的引物特異性強，結(jié)果可靠。

圖3 各組大鼠股骨中RANKL和OPG mRNA相對轉(zhuǎn)錄量的比值Fig.3 Ratio of relative level of mRNA of RANKL to OPG (RANKL/OPG)

M. DL2000 DNA marker；1. RANK；2. RANKL；3. OPG；4. β-actin圖4 各組大鼠股骨中RANKL、RANK和OPG熒光定量PCR擴增結(jié)果Fig.4 Real-time PCR results of RANKL, RANK and OPG mRNA in femur of different groups

3 討 論

骨代謝生化標志物是在骨轉(zhuǎn)換過程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)，反映骨的代謝速率、OC的骨吸收活性和OB的骨形成活性。PINP和β-CTx存在于血液中，是國際骨質(zhì)疏松基金會、國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟推薦使用的標志物[19-21]，分別反映骨形成(PINP)和骨吸收(β-CTx)活性，是評價骨質(zhì)疏松發(fā)生和藥物療效的骨代謝生化標志物，具有靈敏度高、特異性強、準確性較高的特點，在高轉(zhuǎn)換骨質(zhì)疏松模型中顯著升高。本研究模型組的PINP和β-CTx水平均極顯著高于假手術(shù)組，說明疏松骨質(zhì)中的骨形成速率和骨吸收速率均很高，屬高轉(zhuǎn)換骨，而SBCP-Ca可使去卵巢大鼠的PINP和β-CTx水平維持在假手術(shù)組水平，并使股骨中的羥脯氨酸含量和鈣含量增加，避免了高骨轉(zhuǎn)換引起的骨量丟失，有效抑制了骨質(zhì)疏松的發(fā)生，骨組織病理切片也證實如此。

RANK主要表達于單核/巨噬細胞系，在OC前體細胞和成熟OC細胞表面高度表達，是RANKL的唯一已知受體。骨組織中的OC和骨髓基質(zhì)細胞都有分泌和合成RANKL的能力[10-12]。RANK(受體)與RANKL(配體)的結(jié)合將直接促進OC的分化成熟，增強其骨吸收活性并阻止其凋亡[12,22]。OPG是由OB分泌的一種可溶性糖蛋白，廣泛存在于骨組織中[12]，是骨重建的關(guān)鍵因子[6]，是RANKL的誘騙受體，競爭性結(jié)合RANKL，從而阻斷RANK與RANKL的結(jié)合，抑制OC的分化成熟和功能的發(fā)揮[22]。與OPG功能相似或促進OPG表達的藥物開發(fā)將可帶來良好經(jīng)濟收益和社會效益[8]。

本研究結(jié)果表明SBCP-Ca通過減少OC前體細胞表面的RANK受體數(shù)量、抑制OB和骨髓基質(zhì)細胞分泌配體RANKL，增強OB分泌OPG的三重作用來抑制OC的形成和骨吸收活性，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

RANKL/OPG比值可直接影響OC的分化和骨代謝[23], 是調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成平衡的重要因素[24]。本研究中，骨質(zhì)疏松發(fā)生時，盡管OPG水平?jīng)]有變化，但RANKL/OPG比值極顯著升高，而SBCP-Ca可使該比值與假手術(shù)組相似。可見在骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡關(guān)系中，RANKL/OPG是一個重要的調(diào)節(jié)杠桿，可作為判斷骨質(zhì)疏松發(fā)生和藥物作用的一個較為客觀和準確的指標。

4 結(jié) 論

SBCP-Ca通過抑制RANK在破骨前體細胞和成熟破骨細胞的表達，抑制成骨細胞合成和分泌RANKL，促進成骨細胞分泌OPG的三重作用來抑制破骨細胞的形成和骨吸收活性，從而抑制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

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