戴超輝，馮海悅，宗秋芳，吳圣龍,2，包文斌,2*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2.江蘇省種豬繁育和健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，揚州 225009)

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是機體對病原體侵襲產(chǎn)生先天性免疫應答信號通路的一類受體，在宿主免疫反應及炎癥過程中起重要作用[1-2]。TLR5屬于TLRs家族成員，具有模式識別受體的功能，同時它也是機體識別革蘭氏陰性菌鞭毛蛋白的受體，可以介導機體針對病原菌的先天性免疫及炎癥反應[3-5]。KEGG數(shù)據(jù)庫(http:∥www.genome.jp/kegg/pathway.html)顯示，TLR5主要參與了髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88, MyD88)介導的Toll-like信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)以及炎癥性腸病信號通路(Inflammatory bowel disease, IBD)、致病性大腸桿菌感染信號通路(PathogenicEscherichiacoliinfection)、沙門氏菌感染信號通路(Salmonellainfection)和軍團菌病信號通路(Legionellosis)。豬的TLR5基因全長22 359 bp，開放閱讀區(qū)(ORF)長2 571 bp，編碼的蛋白包括胞外區(qū)(LRR結構域)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(TIR結構域)，具有典型的TLR家族結構特征[6]。豬TLR5分子在腎、肝、肺、小腸、脾和胸腺等組織均有表達[6]，并且具有較好的免疫反應性[7]。有研究表明，豬TLR5分子可識別豬霍亂沙門氏菌等細菌的鞭毛蛋白[8-9]，并且TLR5基因的特異單倍型與豬丹毒抗體免疫應答有關[10]。M.A.Dominguez等[11]通過掃描豬TLR5基因的啟動子序列，鑒定了啟動子序列中7個單核苷酸多態(tài)性和兩個Indel變異，其中一個Indel由在-581～-559處核苷酸位置的23 bp插入組成，產(chǎn)生另外的STAT結合位點，從而調(diào)控TLR5的表達。本課題組前期對中國地方豬品種梅山豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型斷奶仔豬十二指腸進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選并初步確定TLRs信號通路可對斷奶仔豬大腸桿菌抗性具有重要調(diào)控作用[12]。上述研究表明，豬TLR5基因在針對外源抗原的固有免疫應答中確實發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。同時其作為Toll-like家族一員不僅本身在菌毛蛋白識別中具有重要作用，而且在斷奶仔豬大腸桿菌抗性調(diào)控中也發(fā)揮重要功能。

在真核生物中，DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，它通過影響染色質(zhì)的結構、DNA的構象、染色體的穩(wěn)定性以及DNA和蛋白質(zhì)的相互作用而調(diào)節(jié)基因表達，最終影響生物學功能[13]。已有研究表明，DNA甲基化在植物抗逆性以及動物的抗病性等方面發(fā)揮了重要作用[14-16]。鑒于豬TLR5基因重要的生物學功能，本研究利用生物信息學分析和雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測確定TLR5基因核心啟動子區(qū)、CpG島及其作用元件，進而分析TLR5基因核心啟動子區(qū)甲基化修飾與斷奶仔豬對F18大腸桿菌抗性的關系，以期為揭示TLR5基因調(diào)控斷奶仔豬大腸桿菌抗性的分子機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗豬來自于課題組前期建立的蘇太豬F18大腸桿菌病抗性型和敏感型資源群體，在3個蘇太豬抗性型和敏感型資源家系中根據(jù)課題組建立的V型分泌系統(tǒng)展呈功能性黏附素和受體結合試驗技術[17]，篩選出確證的抗性型和敏感型個體各3頭(在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，初生重、斷奶重、體形和毛色等性狀基本一致)。在仔豬斷奶前后，也是最易感染E.coliF18而表現(xiàn)出腹瀉癥狀的35日齡階段，屠宰后采集十二指腸和空腸組織樣，現(xiàn)場液氮保存，然后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試驗試劑

胎牛血清FBS、培養(yǎng)液DMEM/F12(DF)、胰酶Trypsin-EDTA Solution、細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板均購自Gibco公司(美國)；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司(美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(中國，南京)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購自南京凱源科技發(fā)展有限公司(中國南京)；兔源一抗TLR5(1∶400)和β-actin(1∶4 000)購自Abcam(Cambridge，UK)；抗兔二抗(IgG-HRP，1∶3 000)購自Jackson(PA，USA)。豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2)由美國賓夕法尼亞大學惠贈；BW23473感受態(tài)細胞購自成都傳世科為生物技術有限公司；pCpGL-basic載體由中國農(nóng)業(yè)大學友情提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒和PyroMark系列試劑盒均購自德國QIAGEN公司；切膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生物技術有限公司(北京，中國)。

1.3 引物設計及序列合成

根據(jù)TLR5基因編碼序列(GenBank登錄號：AB208697.2)設計TLR5基因qPCR引物，以GAPDH為內(nèi)參對目的基因的表達進行均一化。同時設計TLR5基因編碼序列和啟動子區(qū)的PCR擴增引物，確定核心啟動子區(qū)的截短型引物以及進行甲基化檢測的BSP引物。引物的具體信息見表1，所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 擴增序列引物信息Table 1 The primer information of amplification sequences

qPCR代表定量引物，P1～P7分別代表啟動子區(qū)不同區(qū)段的擴增引物，B1和B2分別代表用于啟動子區(qū)甲基化檢測的BSP引物；P1～P7中上下游引物斜體字母分別代表限制性內(nèi)切酶SpeⅠ與NcoⅠ的酶切位點
qPCR represents quantitative primer; P1-P7 represent amplification primers with different regions of the promoter region, respectively; B1 and B2 represent BSP primers for promoter methylation detection, respectively;Italic letters in the upstream and downstream primers of P1-P7 represent the restriction enzymes digestion sites ofSpeⅠ andNcoⅠ

1.4 TLR5在蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型小腸組織中的表達差異檢測

1.4.1 組織總RNA的提取及cDNA合成 嚴格按照說明書，使用Trizol試劑提取F18大腸桿菌抗性型和敏感型蘇太斷奶仔豬十二指腸和空腸組織的總RNA。并以1%甲醛變性凝膠電泳和NanoDrop-1000微量核酸測定儀檢測總RNA的純度和濃度，-70 ℃保存待用。以RNA為模板進行cDNA合成：10 μL的反應體系中含5×qRT SuperMix Ⅱ 2 μL，總RNA 500 ng，RNase free ddH2O補足至10 μL。反應條件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.4.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR反應體系：模板cDNA 2.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，2 × SYBR Premix ExTapTM II 10 μL，50 × ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，RNase free ddH2O補至20 μL，每個樣本設置3個重復。擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；為了分析擴增產(chǎn)物的特異性，在PCR擴增結束后采集多個信息點，進行熔解曲線的分析，具體程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。利用2-ΔΔCt方法計算相對表達量[18]。

1.4.3 Western blot分析 嚴格按照說明書，使用總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，使用BCA試劑盒標準化蛋白質(zhì)水平，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺電泳)條件：10 μL蛋白樣品液上樣至10%濃度凝膠， 120 V電壓電泳90 min。Blotting(蛋白印記)：蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(聚丙烯二氟乙烯膜)，與相關抗體進行免疫印跡，按約0.1 m·cm-2的量加入封閉液和適量一抗TLR5(1∶400)和β-actin抗體(1∶4 000)。HRP抗體作為二抗(辣根過氧化酶標記抗體，二抗用封閉液1∶3 000稀釋)，β-actin蛋白作為參照。

1.5 TLR5啟動子區(qū)確定和作用元件分析

首先根據(jù)TLR5基因組序列(GenBank登錄號：NC_010452.4)截取轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp序列作為模板，通過設計截短型引物(表1)在3′末端對序列進行截短以擴增不同區(qū)段的啟動子片段。將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，條帶正確的送測序驗證。對確證的6對不同引物的PCR產(chǎn)物進行回收純化，然后和pCpGL-basic載體進行雙酶切(SpeⅠ與NcoⅠ)。酶切體系：PCR產(chǎn)物/載體1.0 μg，10×Cutsmart buffer 5.0 μL，SpeⅠ 1.0 μL，NcoⅠ 1.0 μL，ddH2O補至50 μL。37 ℃酶切4 h，利用PCR回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，通過T4連接酶進行連接反應，反應條件為16 ℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BW23473，用無抗生素的低鹽LB培養(yǎng)液220 r·min-1復蘇培養(yǎng)1 h，涂布含博來霉素的抗性平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆搖菌5 h，進行菌液PCR，將電泳條帶正確的菌液進行雙向測序，測序載體上游引物5′→3′F：CTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTT。下游引物為相應PCR擴增的下游引物，對確證的重組菌液進行純化培養(yǎng)和質(zhì)粒抽提，分別命名為-2 000 bp-pCpGL、-1 500 bp-pCpGL、-1 000 bp-pCpGL、-750 bp-pCpGL、-500 bp-pCpGL、-250 bp-pCpGL和-100 bp-pCpGL。

IPEC-J2細胞用含10%胎牛血清的DF培養(yǎng)液培養(yǎng)在12孔板中，培養(yǎng)條件為含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，待生長至80%密度，將7種重組載體分別和海腎熒光素酶TLK載體共轉(zhuǎn)染細胞，48 h后進行雙熒光素酶檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。對雙熒光素酶活性有顯著差異的區(qū)段，通過BDGP軟件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測TLR5基因啟動子區(qū)的核心啟動子區(qū)，利用Alibaba2軟件(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)對豬TLR5基因核心啟動子區(qū)進行轉(zhuǎn)錄因子結合域的分析。

1.6 TLR5啟動子區(qū)CpG島甲基化和mRNA相關性分析

利用MethPrimer軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預測分析豬TLR5基因啟動子區(qū)的CpG島，預測總片段為1 000 bp，預測參數(shù)設定：CpG島指序列長度至少100 bp，GC含量大于50%，CpGo/e大于0.6。為了檢測TLR5基因啟動子區(qū)甲基化水平及其與mRNA表達相關性，以蘇太抗性型和敏感型個體空腸組織DNA為試驗材料，先利用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒對基因組進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，然后利用MethPrimer軟件，基于原序列經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的序列，設計PCR引物，利用PyroMark PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，總體系為25 μL：PyroMark PCR Master Mix 2 × 12.5 μL，CoraLoad Concentrate 10 × 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 2 μL，Q-solution 5 × 5 μL，Primer F/R 各0.5 μL，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA液2 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性 15 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共循環(huán)45次；最后72 ℃ 10 min。用1%的瓊脂糖凝膠鑒定PCR擴增產(chǎn)物后用切膠回收試劑盒回收目的片段，純化后與T載體連接、轉(zhuǎn)化，每個樣本挑取20個陽性克隆菌液送上海生工生物有限公司測序。將經(jīng)甲基化引物擴增的序列和原始DNA序列以及轉(zhuǎn)化序列比對，找出發(fā)生甲基化的CG位點。分別以單個位點甲基化程度與mRNA表達進行相關性分析，利用GraphPad Prism 6繪制關聯(lián)圖譜。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 TLR5在蘇太仔豬不同E.coli F18抗性個體小腸組織中的表達差異分析

利用qPCR檢測了TLR5基因在蘇太斷奶仔豬抗性組與敏感組腸道組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，十二指腸中敏感組個體TLR5基因的mRNA表達水平顯著高于抗性組(P<0.05)，在空腸組織中敏感組極顯著高于抗性組(P<0.01)(圖1A)；Western blot結果表明，敏感組中的TLR5蛋白表達水平也明顯高于抗性組(圖1B)，通過Image J對蛋白條帶灰度面積進行統(tǒng)計，以TLR5蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為灰度值，并把抗性個體灰度值的平均值定義為單位1，對蛋白進行相對定量分析，發(fā)現(xiàn)十二指腸和空腸中敏感組個體TLR5基因的蛋白表達水平均顯著高于抗性組(P<0.05)(圖1C)。

A. mRNA表達水平；B. 蛋白免疫印跡；C. 蛋白相對表達水平。*. P<0.05，**. P<0.01，下同A.The mRNA expression level; B.Western blot; C. The relative protein expression. *. P<0.05, **. P<0.01, the same as below圖1 蘇太豬腸道組織中TLR5基因(蛋白)在抗性組和敏感組中的表達Fig.1 The expression of TLR5 gene (protein) in intestinal tissues of E. coli F18-resistant and sensitive Sutai piglets

2.2 蘇太豬TLR5啟動子區(qū)CpG島和作用元件分析

本研究首先結合雙熒光素酶報告系統(tǒng)和核心啟動子預測軟件確定TLR5基因的啟動子區(qū)和啟動子區(qū)CpG島以及作用元件。啟動子擴增和甲基化擴增結果見圖2，啟動子區(qū)所有截短型引物均擴增正確，重組載體酶切正確，2個CpG區(qū)段擴增正確。熒光素酶活性檢測結果見圖3，啟動子-2 000 bp區(qū)段啟動子活性極顯著高于對照組，且-1 000 bp處活性增加，但差異不顯著；而-500～-250 bp和-250～-100 bp處，啟動子活性顯著降低，說明-500～-250 bp和-250～-100 bp區(qū)域內(nèi)均存在調(diào)控元件，對轉(zhuǎn)錄影響很大，因此重點關注-1 000 bp區(qū)段的啟動子區(qū)域。在線軟件預測了3段TLR5基因的核心啟動子區(qū)，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游13～62 bp、上游255～304 bp和上游864～913 bp，包含2個CpG島，16個作用元件(圖4)。

A. 截短型引物擴增的結果；B. 重組質(zhì)粒酶切結果；C. 甲基化引物擴增結果，其中1～3代表CpG1，4～6代表CpG2。M. DNA相對分子質(zhì)量標準A.The amplification result of promoter fragments; B. The digestion result of recombinant plasmid; C.Amplification results of methylation primers, in which 1-3 represent amplification of CpG1, 4-6 represent amplification of CpG2. M. DL2000 marker圖2 啟動子和甲基化擴增結果Fig.2 Amplification results of promoter and methylation sequences

以螢火蟲熒光素酶Rn活性/海腎素熒光素酶 Ff活性的值作為熒光素酶活性。其中橫坐標代表啟動子區(qū)熒光素酶活性相對于對照質(zhì)粒Basic-pCpGL的差異倍數(shù)，縱坐標代表不同截短的區(qū)段對應的質(zhì)粒，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)The luciferase activity was calculated as the ratio of the activity of firefly luciferase (Rn)/the activity of perineurin luciferase (Ff). The abscissa represents fold change in the luciferase activity of the promoter region compared to the control plasmid Basic-pCpGL. The ordinate represents the plasmids corresponding to the different truncated segments. Different capital letters indicate very significant differences (P<0.01)圖3 TLR5基因啟動子區(qū)不同區(qū)段雙熒光素酶活性檢測Fig.3 Detection of dual luciferase activity in different regions of TLR5 gene promoter region

A. 轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 000 bp處的CpG島預測；B. 基于BDGP軟件的核心啟動子區(qū)預測；C. 啟動子區(qū)作用元件分析，其中帶框堿基代表核心啟動子區(qū)，加粗堿基代表CpG島，下劃線代表作用元件結合位點A. CpG island prediction at 1 000 bp upstream of the transcription start site; B.Prediction of the core promoter region based on BDGP software; C. The analysis of acting elements in promoter region, in which the bases with box represent the core promoter region, bold bases represent CpG island sequences and the underlined bases represent the binding sites of acting elements圖4 TLR5基因核心啟動子區(qū)和CpG島預測以及作用元件分析Fig.4 Prediction of TLR5 gene core promoter region and CpG island and analysis of acting elements

2.3 蘇太豬TLR5啟動子區(qū)CpG島甲基化和mRNA相關性分析

在確定TLR5基因的核心啟動子區(qū)域和作用元件后，通過對圖4C所在的啟動子區(qū)CpG島甲基化分析發(fā)現(xiàn)，CpG1共有6個CG位點，但是發(fā)生甲基化的位點只有3個，并且各位點的甲基化與mRNA表達量并無顯著相關；CpG2總共有15個CG位點，各位點均發(fā)生了不同程度的甲基化，并且第6個CG位點的甲基化與mRNA表達有顯著負相關(P<0.05)(圖5和圖6)，且該位點位于核心啟動子區(qū)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結合位點上。

3 討 論

研究表明，Toll樣受體TLRs家族能夠識別保守的微生物結構(如細菌脂多糖)并激活信號通路，從而導致由微生物感染引起的免疫應答[19]。TLRs能夠感應腸道中的微生物群體，并啟動促炎信號通路來抵抗微生物病原體的入侵[20]。與人源類似，豬源TLRs信號通路也主要分為4種：MyD88依賴通路、TICAM1依賴通路、小GTP酶通路和磷脂酰肌醇(PIPs)通路[21-24]。所有的TLRs均包含TIR結構域，MyD88的TIR結構域都可與之結合；MyD88依賴通路是除TLR3外所有TLRs的共同通路，因此TLR5信號通路屬于MyD88依賴通路，它可以最終激活核因子-κB(Nuclear factor-κB, NF-κB)，導致許多目的基因表達上調(diào)[25]。本課題組前期對中國地方豬品種梅山斷奶仔豬E.coliF18抗性型和敏感型全同胞個體十二指腸組織進行了轉(zhuǎn)錄組學分析，并最終篩選出重要的免疫通路——TLRs信號通路可能與斷奶仔豬大腸桿菌抗性有關[12]。在本研究中，我們檢測了蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體小腸組織中TLR5基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)TLR5基因在蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型十二指腸組織中的表達顯著低于在敏感型中的表達(P<0.05)，其在抗性型空腸組織中的表達極顯著低于在敏感型中的表達(P<0.01)，說明TLR5基因的表達水平確實和大腸桿菌的抗性有關，并且進一步推斷其低表達可能有利于斷奶仔豬抵抗大腸桿菌侵染。本試驗結果與TLR5作為細菌受體的生物學功能是一致的，其作為Toll-like家族一員不僅本身在菌毛蛋白識別中具有重要作用，并且在斷奶仔豬大腸桿菌抗性調(diào)控中也發(fā)揮著重要功能。至于TLR5基因的表達是通過什么途徑來調(diào)控大腸桿菌抗性的，有必要對TLR5基因調(diào)控大腸桿菌的分子機制進行進一步分析。

圖5 TLR5基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度分析Fig.5 The methylation analysis of CpG islands in TLR5 gene promoter region

圖6 TLR5基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度與mRNA表達的相關性分析Fig.6 The correlation analysis between methylation degree of CpG islands in TLR5 gene promoter region and mRNA expression

基因表達調(diào)控的方式有很多種，其中啟動子區(qū)DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因功能的重要手段。Z.Z.Xiao等[26]對豬LYN基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及基因表達水平進行了分析，結果顯示，甲基化對豬LYN基因的轉(zhuǎn)錄起著重要作用。L.Sun等[27]證實了豬BPI啟動子區(qū)mC-15位點的甲基化可以抑制C/EBPβ與啟動子結合的能力，并影響其表達。因此，我們對TLR5基因啟動子開展了一系列研究。我們首先根據(jù)雙熒光素酶活性檢測和軟件預測了TLR5基因的核心啟動子區(qū)和CpG島，利用BSP克隆測序分析了啟動子區(qū)的2個CpG島各位點的甲基化程度，并與mRNA表達水平進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)第2個CpG島第6個CG位點甲基化水平對TLR5基因的表達具有一定的調(diào)控作用。而這個CG位點位于轉(zhuǎn)錄因子Sp1結合域，因此我們推測TLR5基因啟動子區(qū)第2個CpG島第6個CG位點甲基化阻礙了轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結合，從而抑制TLR5基因的表達，并最終影響大腸桿菌的抗性。本研究結果表明，TLR5基因啟動子區(qū)存在調(diào)控TLR5基因表達的CpG島(第2個CpG島)，其中存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(SP1)結合的重要CG位點(mC-6)。我們推測，當仔豬受到F18大腸桿菌侵襲時，TLR5基因啟動子區(qū)第2個CpG島第6個CG位點發(fā)生甲基化阻礙了轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結合，進而抑制TLR5基因的表達，并最終表現(xiàn)出對大腸桿菌的抗性。下一步將在細胞水平進一步驗證TLR5基因的調(diào)控功能，并結合免疫共沉淀或凝膠遷移試驗等技術深入研究轉(zhuǎn)錄因子對核心啟動子的調(diào)控作用，以期為TLR5基因的表觀遺傳修飾作用提供更完整的試驗依據(jù)。

4 結 論

本研究首先通過組織和蛋白表達水平初步確定TLR5表達與大腸桿菌抗性的關系，發(fā)現(xiàn)豬TLR5基因的表達水平確實和F18大腸桿菌的抗性有關，其低表達可能有利于F18大腸桿菌抗性。然后通過啟動子區(qū)CpG島甲基化分析，預測并確定了TLR5核心啟動子區(qū)和甲基化位點，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)第2個CpG島第6個CG位點甲基化水平和TLR5基因的表達存在顯著負相關。由此推測TLR5基因啟動子區(qū)第2個CpG島第6個CG位點甲基化能夠顯著抑制TLR5基因的表達，并最終影響斷奶仔豬對大腸桿菌的抗性。

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