胡 俊,湯 斌，李 松

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000)

抗菌肽是一種常見的生物拮抗劑，主要表現(xiàn)為對一些G+細(xì)菌(特別是一些致病菌，如金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等)具有一定的拮抗作用[1]，因而在環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療衛(wèi)生和食品加工等眾多領(lǐng)域都有著較為重要的應(yīng)用．利用微生物生產(chǎn)抗菌肽具有生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物易分離純化等優(yōu)點(diǎn)[2]，是工業(yè)上抗菌肽的主要獲得途徑．

抗菌肽純化方法主要包括膜分離、電泳分離、層析技術(shù)以及高效液相色譜分離等[3]．在利用高效液相色譜(HPLC)對發(fā)酵液中的抗菌肽組分進(jìn)行分離時，需要先對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，以降低分離體系中的蛋白豐度、分離難度以及避免造成儀器損壞．從目前的研究現(xiàn)狀來看，預(yù)處理方式主要包括鹽析、色譜柱粗分離、分級沉淀和有機(jī)萃取等[4]．胡瑞萍[5]等采用鹽酸沉淀和Sephadex G-50 凝膠柱分離對枯草芽孢桿菌BSD-2抗菌肽進(jìn)行了粗提??；劉靜[6]等在枯草芽孢桿菌抗菌肽分離純化過程中，采用陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF等方式對發(fā)酵粗提液進(jìn)行預(yù)處理；劉穎[7]等在分離抗真菌肽的過程中，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度以及利用丙酮分級沉淀等方法對目的蛋白進(jìn)行了粗提．由于抗菌肽具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性較高且在有機(jī)溶劑和水中都具有一定的溶解性等特點(diǎn)[8]，所以，利用合適的有機(jī)溶劑對發(fā)酵液中的抗菌肽進(jìn)行萃取可使其中大多數(shù)雜蛋白變性沉淀，而分子量較小的多肽類物質(zhì)可部分轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中．相比其他的預(yù)處理方式，此方法操作簡單且能取得較好的預(yù)處理效果，使后續(xù)HPLC分離過程簡化，因而以此作為發(fā)酵液的預(yù)處理方法．

研究以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株時，發(fā)酵液預(yù)處理操作過程中的各實驗因素對抗菌肽的萃取效果和相對應(yīng)的反萃取效果的影響，以及最佳萃取試劑、萃取和反萃取條件的確定，最終通過蛋白豐度檢測對預(yù)處理效果進(jìn)行了評估．相比其他預(yù)處理方式，此方法操作簡單且能較好地達(dá)到預(yù)處理效果，使后續(xù)HPLC分離過程簡化，因而選擇此方法作為發(fā)酵液的預(yù)處理方法．

1 實驗材料

(1)菌種.地衣芽孢桿菌BL32、金黃色葡萄球菌AS1.2465(以上菌株均為安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵工程研究中心實驗室篩選保藏)．

(2)試劑與儀器.試劑:氨芐青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(160 萬U/g，純度≥99.9%)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、95%乙醇、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、異戊醇(AR)、硫酸鎂(AR)、碳酸鈣(AR)、可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母粉(以上藥品均購自國藥集團(tuán)公司)以及市售豆粕．

儀器：NS4201二元分析液相色譜系統(tǒng)、RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FD8-3冷凍干燥機(jī)、電熱鼓風(fēng)式干燥箱．

(3)培養(yǎng)基.LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉1.5%；種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，豆粕2%，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣0.05%．

2 實驗方法

2.1 發(fā)酵液的獲得

(1)種子液制備.用接種環(huán)從斜面菌種保藏管中挑取菌體接種于20 mL種子培養(yǎng)基中，于37 ℃環(huán)境中200 r/min震蕩培養(yǎng)18 h備用．

(2)發(fā)酵液的獲取.配制上述發(fā)酵培養(yǎng)基并加入10 L發(fā)酵罐(BIOTECH-10JS-9000C，上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中進(jìn)行實罐滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至室溫時接入2%的地衣芽孢桿菌種子液．控制發(fā)酵條件為37 ℃、溶氧30%(串聯(lián)轉(zhuǎn)速)，發(fā)酵過程中恒定pH 6.5(10% 氨水調(diào)節(jié))，發(fā)酵時間為30 h．發(fā)酵結(jié)束后[9]，將發(fā)酵液進(jìn)行8 000 r/min離心10 min，取上清液備用．

2.2 抗菌效價與抗菌肽相對含量計算方法

(1)抗菌實驗方法.抗菌實驗方法采取瓊脂表面擴(kuò)散法[10]．在LB平板表面涂布指示菌，同時在培養(yǎng)基表面放置牛津杯(規(guī)格：內(nèi)徑φ=8 mm)．向牛津杯中加入100 μL待測液，平板置于一定的條件下培養(yǎng)，后測定牛津杯周圍的抑菌圈直徑大?。?/p>

(2)抗菌效價計算方法.準(zhǔn)確稱取氨芐青霉素鈉1.000 g，利用超純水配制濃度為1.000 g/mL(160 萬抗菌單位)的氨芐青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]，對此標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋分別配制2～20 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用．取一定量的樣液置入無菌EP管中用無菌水梯度稀釋5～15倍，經(jīng)0.22 μm的無菌過濾器過濾后按2.2(1)的方法進(jìn)行抗菌實驗．樣液抑菌效價的測定采用國際上通用的抗生素效價測定方法“杯碟法”中的二計量法[12]．即根據(jù)下列公式和抑菌圈的大小得出相應(yīng)的抗菌效價．

(3)抗菌肽相對含量的測定方法.根據(jù)樣液中抗菌物質(zhì)的含量與其抗菌效價成正比的關(guān)系，樣液中抗菌肽的相對含量主要是通過測定抑菌效價的方式體現(xiàn)的．發(fā)酵液中抗菌肽相對含量直接通過原發(fā)酵液的抗菌效價判斷，萃取操作后溶于有機(jī)溶劑和超純水中的抗菌肽相對含量測定方法如下：10 000 r/min離心5 min，收集有機(jī)相或水相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后60 ℃烘干，溶質(zhì)利用5 mL超純水重新溶解后經(jīng)0.22 μm水膜過濾．按2.2(2)所述方法測定溶解液抗菌效價．

2.3 發(fā)酵液中抗菌肽萃取條件的研究

(1)不同有機(jī)溶劑對萃取效率的影響.分別以氯仿、四氯化碳、正丁醇、異戊醇和混合醇(正丁醇∶異戊醇=1∶1)為萃取用的有機(jī)萃取劑．將有機(jī)溶劑與原發(fā)酵液上清液按體積比1∶1混合進(jìn)行萃取操作．分別收集有機(jī)相和發(fā)酵液并對其中抗菌肽的相對含量進(jìn)行測定．每種有機(jī)溶劑設(shè)3個平行組，抑菌性效價取相對應(yīng)的平均值．

(2)萃取機(jī)溶劑/發(fā)酵清液的體積比對萃取效率的影響.控制有機(jī)溶劑與發(fā)酵清液的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進(jìn)行萃取，測定有機(jī)相和水相中的抗菌肽相對含量．各體積比設(shè)3個平行組，抑菌性效價取相對應(yīng)的平均值．

(3)萃取溫度對萃取效率的影響.取適量的有機(jī)溶劑和發(fā)酵上清液分別置入水浴鍋中保溫30 min，水浴鍋的溫度分別設(shè)置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和65 ℃．后迅速將有機(jī)溶劑與培養(yǎng)液清液按合適的體積比混合，分別收集有機(jī)相和發(fā)酵液，對兩者溶解的抗菌肽相對含量進(jìn)行測定．各溫度條件下設(shè)3個平行組，抑菌性效價取相對應(yīng)的平均值．

2.4 反萃取條件的研究

反萃取是指在萃取操作以后，將溶解有抗菌肽的有機(jī)溶劑與超純水混合，使得有機(jī)溶劑中部分抗菌肽轉(zhuǎn)移至水相的實驗過程，目的是為了進(jìn)一步降低待分離體系中的蛋白豐度．

(1)有機(jī)相/超純水體積比對反萃取效果的影響.分別設(shè)置反萃取過程中 V有機(jī)相/V超純水比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在常溫下充分震蕩混合均勻，按2.2(2)方法對各組有機(jī)相以及水相中的抗菌肽相對含量進(jìn)行測定．各體積比設(shè)3個平行組，抑菌性效價取相對應(yīng)的平均值．

(2)溫度對反萃取效果的影響.取適量的有機(jī)溶劑和超純水分別置于溫度設(shè)置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃水浴鍋中保溫30 min后迅速將有機(jī)溶劑與超純水按合適的體積比混合，測定各組有機(jī)溶劑和水相中抗菌肽的相對含量．各溫度條件下設(shè)3個平行組，抑菌性效價取相對應(yīng)的平均值．

(3)反萃取操作次數(shù)對實驗效果的影響.在最適操作溫度條件下，按最適體積比將含有抗菌肽的有機(jī)溶劑與超純水進(jìn)行混合，充分震蕩后離心．收集上層有機(jī)相再一次按體積比加入超純水重復(fù)上述操作2至5次，分別對每次有機(jī)相中剩余的抗菌肽相對含量進(jìn)行測定．各操作次數(shù)設(shè)3個平行組，抑菌性效價取相對應(yīng)的平均值．

2.5 蛋白豐度的檢測

分別取發(fā)酵濃縮液、萃取操作后溶有抗菌肽的有機(jī)溶劑以及反萃取后溶有抗菌肽的水溶液經(jīng)0.45 μm膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析．色譜檢測條件分別為柱型C18柱(規(guī)格：250×8 mm)，操作溫度25 ℃；有機(jī)相(A相)為乙腈(色譜純)；非有機(jī)相(B相)為超純水；A相由起始濃度30%上升至結(jié)束濃度60%;檢測光波長254 nm;分離時間30 min;進(jìn)液量20 μL．

3 結(jié)果與分析

3.1 萃取實驗條件優(yōu)化

不同有機(jī)溶劑萃取液的萃取效率和抑菌效果如圖1、圖2所示.由圖2可知，以正丁醇為萃取溶劑時形成的抑菌圈的直徑較大即以正丁醇為有機(jī)溶劑時,發(fā)酵液中的抗菌肽可較多的轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，其萃取率為33.14%.其次為混合醇，萃取效果最差的為四氯化碳，其對抗菌肽的萃取率僅有8.28%.

V有機(jī)溶劑/V發(fā)酵液對萃取效果的影響如圖3所示.溫度對萃取效果的影響如圖4所示.由圖3可知，萃取過程中，不同的有機(jī)相與發(fā)酵液的體積比對萃取效果有一定的影響，其中設(shè)定V有機(jī)相/V發(fā)酵液為2∶1時，抗菌肽的萃取相比于V有機(jī)相/V發(fā)酵液為1∶1提高了8.53%．但之后有機(jī)溶劑量繼續(xù)增加時，萃取率上升并不明顯．同時由圖4可得操作溫度大于45 ℃時，萃取率趨于穩(wěn)定，但相對于室溫條件下提高了4.5%左右．

由以上優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析可得出，在發(fā)酵液的萃取預(yù)處理的過程中，以正丁醇為萃取試劑，最佳效益的萃取條件V有機(jī)相/V發(fā)酵液為2∶1，萃取溫度為45 ℃．

圖1 有機(jī)溶劑對抗菌肽的萃取效率圖2 不同有機(jī)溶劑萃取液的抑菌效果

圖3 V有機(jī)溶劑/V發(fā)酵液對萃取效果的影響圖4 溫度對萃取效果的影響

3.2 反萃取條件優(yōu)化

不同的V有機(jī)相/V超純水對反萃取效果的影響如圖5所示.不同溫度對反萃取效果的影響如圖6所示.有機(jī)相中殘留抗菌效價與反萃取次數(shù)的關(guān)系如圖7所示.由圖5、圖6、圖7可知，在實驗操作中不同的V有機(jī)相/V超純水對反萃取的效果沒有較為顯著影響；相對于室溫環(huán)境，設(shè)定反萃取操作溫度為45 ℃時，單次反萃取率有所提高．而在最適反萃取條件下進(jìn)行重復(fù)操作，進(jìn)行2次反萃取時，反萃取率相對于單次操作提高了7.84%．因此，在反萃取操作中，設(shè)定V有機(jī)相/V超純水為1∶1、操作溫度為45 ℃、操作次數(shù)為2次時可獲得較好的反萃取效益，反萃取率接近61.28%．

圖5 不同的V有機(jī)相/V超純水對反萃取效果的影響圖6 不同溫度對反萃取效果的影響

圖7 有機(jī)相中殘留抗菌效價與反萃取次數(shù)的關(guān)系

圖8 原發(fā)酵液蛋白豐度檢測結(jié)果

3.3 蛋白豐度的檢測結(jié)果分析

原發(fā)酵液樣品色譜檢測結(jié)果如圖8所示.由高效液相色譜檢測數(shù)據(jù)可以看出，在原發(fā)酵液樣品圖譜中出現(xiàn)峰數(shù)目較多，可見原發(fā)酵液中蛋白豐度較大，在此基礎(chǔ)上很難直接對抗菌肽進(jìn)行分離收集．但經(jīng)過有機(jī)萃取操作后，對比原發(fā)酵液的檢測結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，圖譜中峰數(shù)目明顯下降及大部分的雜蛋白組分可在正丁醇的作用下變性沉淀，繼而被除去(見圖9)．進(jìn)一步經(jīng)過反萃取操作，對比圖9可知，分離時間大于6.5 min出現(xiàn)的蛋白組分在水相中溶解度較小并被截留在有機(jī)相中，水相的蛋白組分明顯下降(見圖10)．因此通過以上兩步的操作，使得最終待分離體系中的蛋白組成相對簡單，從而達(dá)到了較為理想的處理效果．

圖9 萃取操作后溶于有機(jī)相蛋白豐度檢測結(jié)果

圖10 反萃取操作后溶于水相蛋白豐度檢測結(jié)果

4 結(jié)論

有機(jī)萃取是抗菌肽純化工藝中發(fā)酵液的預(yù)處理方法，相比與其他方法具有高效簡便的優(yōu)點(diǎn)．以正丁醇為有機(jī)萃取劑，在合適的V有機(jī)相/V發(fā)酵液和操作溫度條件下，可使地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中抗菌肽最大限度地轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，然后進(jìn)一步進(jìn)行反萃取操作，對影響其效果的操作溫度和反萃取操作次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化．在45 ℃條件下，二次反萃取率接近61.28%，萃取操作可使發(fā)酵液中大多數(shù)雜蛋白組分被除去，使得后期高效液相色譜的分離工作難度大大降低，從而起到了相應(yīng)的預(yù)處理效果．

[1] 全艷玲.地衣芽孢桿菌對有害微生物的拮抗作用[J].食品科學(xué)，2002，8(22):68-69.

[2] 喻鋼,田萬紅,董思國,等.枯草芽孢桿菌抗菌肽的分離純化及質(zhì)譜檢測[J].藥物分析雜志,2014，34(10):1 902-1 906．

[3] 張亞,蘇品，廖曉蘭,等.多肽的分離純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2013,33(5):87-91.

[4] 龐秀枰,馬裕欽.小分子肽分離技術(shù)研究進(jìn)展[J].廣東化工,2015,2(42):89-90.

[5] 胡瑞萍，張鐸，張麗萍，等.枯草芽孢桿菌BSD-2一種抗菌肽的分離純化與鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報,2011,26(6):201-206.

[6] 劉靜，王軍，姚建銘，等.枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J].微生物學(xué)報，2004，44(4)：511-514.

[7] 劉穎,徐慶,陳章良.抗真菌肽LP-1的分離純化及特性分析[J].微生物學(xué)報，1999，30(5):441-449.

[8] T WANG,Y F LIANG,M B WU,et al.Natural products from bacillus subtilis with antimicrobial properties[J].Chinese Journal of Chemical Engineering，2015(23):744-754.

[9] 溫小娟，閆淑珍，劉維紅，等.拮杭性類芽孢桿菌F53菌株的固體發(fā)酵條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,35(2):461-463.

[10] 沈萍,范秀榮,李廣武.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2006.

[11] 曾東方,陳玢,桓嬌,等.塑料管碟法測定抗生素的抗菌活性[J].生物學(xué)通報，2011，46(8):48.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典附錄Ⅵ[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005.