樊 英, 許 拉, 王曉璐, 李 樂, 蓋春蕾, 于曉清, 李天保, 葉海斌

(山東省海洋生物研究院, 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266104)

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)隸屬于弧菌科弧菌屬，是海水中一種常見的病原菌，在海洋環(huán)境中分布很廣，主要感染蝦及魚類[1-2].通常情況下，哈維氏弧菌是凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvanname)的正常菌群;在養(yǎng)殖動(dòng)物自身健康或養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生變化的情況下，該菌開始大量繁殖，通過不同方式不同程度地打破宿主微生態(tài)平衡，損傷宿主的組織結(jié)構(gòu).對(duì)蝦被感染后一般會(huì)出現(xiàn)肝胰腺混沌、白鰓、紅腿、肌肉白濁等癥狀[3].目前發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌的致病性相關(guān)因子主要為胞外產(chǎn)物(extracellular products, ECP)，包括蛋白酶、溶血素、外毒素、脂多糖等，還與噬菌體介導(dǎo)的毒力基因轉(zhuǎn)移相關(guān)[4-7].弧菌的致病過程與對(duì)蝦生理狀態(tài)、環(huán)境脅迫、菌的攻毒方式等相關(guān).注射和浸浴是病原學(xué)研究中常見的攻毒手段.本文研究凡納濱對(duì)蝦在不同濃度和不同感染途徑的哈維氏弧菌作用下，腸道組織形態(tài)、腸道弧菌數(shù)量及蝦體死亡率的變化，為闡明哈維氏弧菌的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 攻毒對(duì)象及養(yǎng)殖條件

健康的凡納濱對(duì)蝦來自山東濱州某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)約3.5 cm.正式試驗(yàn)前，凡納濱對(duì)蝦暫養(yǎng)于塑料桶(85 cm×55 cm×45 cm)內(nèi)4 d，連續(xù)充氣，以配合飼料飽食投喂.養(yǎng)殖水體鹽度為18‰，水溫26 ℃，pH 8.0，亞硝酸鹽含量0.01 mg·L-1，氨氮含量0.01 mg·L-1.隨后將凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分組，每組20尾.在攻毒試驗(yàn)前禁食1 d.

1.2 供試菌株及致病性

試驗(yàn)所用攻毒菌株是從某養(yǎng)殖場(chǎng)瀕死對(duì)蝦肝胰腺分離的哈維氏弧菌，由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、保存(命名TCBS-G).通過預(yù)試驗(yàn)確定哈維氏弧菌的半致死濃度LD50(7 d)為1.3×107CFU·mL-1.

將分離純化的哈維氏弧菌接種于2216e液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)20 h，通過分光光度計(jì)560 nm(D560 nm)比濁測(cè)定后備用.將供試菌液(1.8×107CFU·mL-1)300 mL加入20 L水體中，浸泡20尾試驗(yàn)對(duì)蝦，對(duì)照組為同體積無菌生理鹽水.浸泡12 h后撈出試驗(yàn)對(duì)蝦，徹底換水，健康養(yǎng)殖條件下暫養(yǎng)4 d，每天觀察對(duì)蝦被感染后的發(fā)病與死亡情況，以瀕死對(duì)蝦重新分離到原感染菌為致病性判定指標(biāo).

1.3 注射攻毒試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)立對(duì)照組和不同濃度的哈維氏弧菌試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行.將供試弧菌濃度通過無菌生理鹽水稀釋至105和107CFU·mL-1.采用1 mL無菌注射器將0.1 mL稀釋哈維氏弧菌注射入凡納濱對(duì)蝦第五至第六腹節(jié)處，對(duì)照組注射同體積的無菌生理鹽水.監(jiān)測(cè)所有凡納濱對(duì)蝦在哈維氏弧菌感染后的生存情況，并記錄死亡的時(shí)間，試驗(yàn)周期為7 d.

1.4 浸浴攻毒試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，共設(shè)立3個(gè)處理組.將活化的哈維氏弧菌供試菌液[105和107CFU·mL-1]300 mL加入20 L水體中，浸泡20尾試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦，同時(shí)設(shè)同體積無菌生理鹽水作為對(duì)照，每組3個(gè)平行.隔離養(yǎng)殖于試驗(yàn)水箱中，浸泡過夜后撈出試驗(yàn)對(duì)蝦，徹底換水，暫養(yǎng)，每天觀察凡納濱對(duì)蝦感染后的發(fā)病與死亡情況，試驗(yàn)周期為7 d.

1.5 凡納濱對(duì)蝦腸道對(duì)哈維氏弧菌感染的響應(yīng)

在供試菌株感染凡納濱對(duì)蝦12、24、48、72、96 h，分別從對(duì)照組和攻毒試驗(yàn)組中隨機(jī)挑取瀕死的凡納濱對(duì)蝦3尾，冰上解剖，獲取腸道，-80 ℃無菌保存，備用.將腸道內(nèi)容物稀釋后置于TCBS選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行弧菌計(jì)數(shù).將48 h中腸組織樣品置于Bouin氏液中固定，放入不同濃度酒精進(jìn)行梯度脫水后浸蠟、包埋，使用切片機(jī)(SHANDON, AS325)連續(xù)7 μm切片，干燥后利用蘇木精—伊紅(HE)染色法染色，最后觀察并進(jìn)行顯微攝影(OLYMPUS, BX53F).

1.6 計(jì)算公式及統(tǒng)計(jì)方法

累積死亡率/%=Dt/D0×100(D0和Dt分別為攻毒過程中凡納濱對(duì)蝦初始數(shù)量和累計(jì)死亡數(shù)量).

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若差異顯著，則用Duncan′s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌的致病性

凡納濱對(duì)蝦被供試哈維氏弧菌感染后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而對(duì)照組在4 d觀察期內(nèi)均正常.發(fā)病蝦體發(fā)白，肝胰腺出現(xiàn)混濁狀態(tài)，有的呈現(xiàn)淺白色，提取腸胃樣品肉眼觀察，呈現(xiàn)空、透現(xiàn)象；被感染的瀕死對(duì)蝦經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，分離到大量的感染菌，其形態(tài)及理化特性與原感染菌一致(表1).

2.2 注射方式對(duì)感染凡納濱對(duì)蝦的影響

圖1顯示，高濃度(107CFU·mL-1)試驗(yàn)組的對(duì)蝦在第1天便出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，第3天死亡率達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定；低濃度(105CFU·mL-1)試驗(yàn)組對(duì)蝦出現(xiàn)死亡的時(shí)間與高濃度試驗(yàn)組相近，但死亡數(shù)量相對(duì)較少，第4天達(dá)到最大值.

2.3 浸浴方式對(duì)感染凡納濱對(duì)蝦的影響

圖2顯示，高濃度(107CFU·mL-1)試驗(yàn)組對(duì)蝦在第1天的死亡情況較低濃度(105CFU·mL-1)試驗(yàn)組嚴(yán)重，第2天死亡數(shù)量急劇增大，第3天死亡率達(dá)到最大值；低濃度試驗(yàn)組死亡情況相對(duì)平緩，第4天達(dá)到最大值.

表1 供試菌生化反應(yīng)結(jié)果(陸橋生物有限公司試劑盒)1)Table 1 Biochemical reaction results of V.harveyi tested (Beijing Land Bridge Technology CO, LTD)

1)“+”表示陽(yáng)性,“-”表示陰性.

圖1 注射哈維氏弧菌7 d內(nèi)凡納濱對(duì)蝦累積死亡率Fig.1 Accumulative mortality of L.vannamei injected V.harveyi in 7 days

2.4 腸道內(nèi)容物弧菌數(shù)量對(duì)不同攻毒方式的響應(yīng)

不同攻毒方式導(dǎo)致弧菌數(shù)量出現(xiàn)不同程度的增加.注射12 h腸道弧菌數(shù)量未見顯著變化(P>0.05)，第3天達(dá)到最多，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；而浸浴第1天腸道弧菌數(shù)量即大量增加，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，第2天達(dá)到最大值，隨后弧菌數(shù)量發(fā)生回落(表2).

表2 攻毒方式對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物弧菌數(shù)量的影響1)Table 2 Effect of infection methods on Vibrio number in the gut of L.vannamei

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤.同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05).

2.5 腸道組織結(jié)構(gòu)對(duì)不同攻毒方式的響應(yīng)

由圖3可見，在不同攻毒方式和不用濃度哈維氏弧菌作用下，對(duì)蝦腸道組織可分為輕度感染和重度感染.輕度感染主要發(fā)生于低濃度注射試驗(yàn)組，其癥狀為腸道上皮細(xì)胞邊緣略變薄(圖3B).重度感染主要發(fā)生于高濃度試驗(yàn)組，且浸浴感染較嚴(yán)重，癥狀主要為上皮細(xì)胞損傷、變形并脫落，細(xì)胞核裂解，嚴(yán)重者腸黏膜褶皺處向下沉落或脫落，腸壁上環(huán)肌肉與縱肌層也有脫落(圖3F)；高濃度注射試驗(yàn)組表現(xiàn)為細(xì)胞核模糊不清，少許出現(xiàn)上皮細(xì)胞與固有層分離現(xiàn)象(圖3C).

A.注射對(duì)照組;B.105 CFU·mL-1注射試驗(yàn)組;C.107 CFU·mL-1注射試驗(yàn)組;D.浸浴對(duì)照組;E.105 CFU·mL-1浸浴試驗(yàn)組;F.107 CFU·mL-1浸浴試驗(yàn)組.圖3 不同攻毒方式下凡納濱對(duì)蝦腸道組織結(jié)構(gòu)的變化Fig.3 Change of gut histological structure of L.vannamei infected by different methods

3 討論

對(duì)蝦被致病菌感染后，在血淋巴、肌肉及肝胰腺內(nèi)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答等多方面呈現(xiàn)對(duì)外界致病菌的防御，但是針對(duì)不同攻毒方式下弧菌與對(duì)蝦腸道相互作用的研究極為缺乏.Rajendran et al[8]針對(duì)甲殼類生物開展了哈維氏弧菌浸浴攻毒試驗(yàn)，觀察發(fā)現(xiàn)浸浴侵染后的動(dòng)物組織形態(tài)變化與自然侵染相似，說明浸浴攻毒是一種最為自然并且行之有效的侵染生物體的方式[9-10].然而，不同攻毒方式造成的損傷不同，涉及不同的致病機(jī)理.注射攻毒是將病菌經(jīng)對(duì)蝦腹節(jié)處注射到肌肉內(nèi)，經(jīng)過自身系統(tǒng)循環(huán)，分散至全身，到達(dá)腸道需要一定的時(shí)間和過程；浸浴攻毒是致病菌經(jīng)對(duì)蝦口或鰓被攝入體內(nèi)，之后到達(dá)腸道，進(jìn)而傷及全身其他部位和功能.因此，浸浴攻毒比注射攻毒更容易損傷蝦體的腸道組織.本研究中，浸浴攻毒后對(duì)蝦出現(xiàn)死亡的時(shí)間比注射攻毒早且狀況嚴(yán)重.

甲殼動(dòng)物被哈維氏弧菌感染后會(huì)出現(xiàn)許多疾病[9-10].Diggles et al[10]研究表明，綠巖龍蝦(Jasusverreauxi)被哈維氏弧菌感染后出現(xiàn)蠶食現(xiàn)象，外表皮受傷更便于哈維氏弧菌的寄居繁殖，加重病害程度和發(fā)生范圍.Jayasree et al[11]發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)在被哈維氏弧菌感染后出現(xiàn)附肢發(fā)紅、外表皮松軟及白便等癥狀，這與本研究中凡納濱對(duì)蝦被哈維氏弧菌感染后表現(xiàn)的癥狀相似.

對(duì)蝦腸道黏膜褶皺的高低和疏密、上皮細(xì)胞的完整性和數(shù)量等會(huì)影響腸道性能[9,12].正常腸上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間隙清晰，內(nèi)壁為高柱狀上皮組織，腸內(nèi)壁向腸腔凸起形成褶皺[13].對(duì)蝦被致病菌感染后，其上皮組織損傷開始于上皮細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)明顯變薄，隨著侵染的加深，腸道上皮細(xì)胞核肥大，核邊緣模糊不清，上皮細(xì)胞核最終完全降解形成胞內(nèi)空洞[14].本研究發(fā)現(xiàn)，在不同方式、不同濃度弧菌攻毒后對(duì)蝦腸道的組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為輕度感染和重度感染.隨著弧菌濃度的提高和攻毒時(shí)間的延長(zhǎng)，中腸組織損傷情況逐漸加重.重度感染表現(xiàn)為上皮細(xì)胞完全潰散并脫落，肌層也被損傷.此外，對(duì)蝦腸道在受到哈維氏弧菌侵染后，黏膜褶皺處發(fā)生皺縮或損傷直至脫落.然而，有關(guān)對(duì)蝦的腸道修復(fù)機(jī)制需進(jìn)一步深入研究.

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