葛 超 王紅艷 董益利 李 季徐 蕓 顧秋予蘇 志 錢 勇＊, Peter J.Sadler 劉紅科＊,

(1南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)(2Department of Chemistry，University of Warwick，Gibbet Hill Road，Coventry CV4 7AL，UK)

0 引 言

1965年，美國(guó)科學(xué)家Rosenberg首次發(fā)現(xiàn)順鉑能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并開展了抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[1]。由于順鉑的抗藥性及毒副作用，人們將研究擴(kuò)展到了過(guò)渡金屬配合物抗癌方面，已報(bào)道了很多新型具有低毒、高效抗癌活性的金屬(如鉑、鈀、銠、銥、鋨、釕等元素)配合物，其中釕配合物抗癌成為研究熱點(diǎn)[2]。Sadler等發(fā)現(xiàn)雙核芳基釕配合物對(duì)光敏感，具有結(jié)合光誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和光活化熒光成像的潛力[3]。Dyson等設(shè)計(jì)了一系列的含膦配體的芳基釕配合物并研究芳烴結(jié)構(gòu)變化對(duì)抗癌活性的影響[4]。

在螯合配體中，吡啶類化合物由于容易進(jìn)行化學(xué)修飾得到系列衍生物，比其它氮雜環(huán)化合物更有優(yōu)勢(shì)，其與芳基釕配位一般有2種方式，N^N配位及C^N配位。值得注意的是，含有N，N-螯合配體的芳基釕配合物不僅在催化反應(yīng)中表現(xiàn)優(yōu)異，而且它們良好的抗癌活性也令人矚目[5-6]。Sheldrick和同事已經(jīng)報(bào)道了一系列具有N，N-螯合多吡啶基配體的銠和銥配合物[7]，它們表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒性并通過(guò)配位、插入或雙重結(jié)合的方式與DNA作用[8]。

抗癌配合物水解速率的大小對(duì)抗癌活性有重要影響，含有鹵素離去基團(tuán)的芳基釕配合物進(jìn)入體內(nèi)更容易在細(xì)胞質(zhì)里發(fā)生水解而不是血液里，因?yàn)檠豪顲l-濃度比較高抑制了配合物的水解 (大約100 mmol·L-1)，而細(xì)胞質(zhì)中的 Cl-濃度低(＜25 mmol·L-1)，促進(jìn)水解，水解后帶正電荷的水解產(chǎn)物可能進(jìn)入細(xì)胞核與帶負(fù)電荷的DNA作用造成DNA損傷，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[9]。DNA是抗癌化合物在細(xì)胞內(nèi)的主要靶標(biāo)之一，核酸和其他分子之間的相互作用是生命科學(xué)中的基本問(wèn)題[10]。一些疾病的標(biāo)志性物質(zhì)和DNA靶向藥物的相互作用機(jī)制涉及基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、突變和物種的相關(guān)變異等[11]。血清白蛋白是一種重要的生物分子，也是重要的血液蛋白質(zhì)，其具有轉(zhuǎn)運(yùn)配體如脂肪酸、氨基酸、類固醇、金屬離子和藥物的能力[12-13]。藥物-白蛋白在血流中的結(jié)合能力對(duì)藥物的活體分布、游離濃度、代謝和排泄性質(zhì)有重要影響，同時(shí)也影響化療過(guò)程中的藥物穩(wěn)定性和毒性[14]。由于牛血清白蛋白與人血清白蛋白含90%的相同序列，性質(zhì)差別小，其價(jià)格低，許多文獻(xiàn)也用牛血清白蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以本文選擇用牛血清白蛋白來(lái)研究配合物與蛋白的相互作用[15]。

Scheme 1 Synthetic route and general structures of complexes 1 and 2

研究導(dǎo)致配合物抗癌活性降低的因素也具有特別重要的意義。通過(guò)對(duì)配合物的水解、與靶標(biāo)物質(zhì)如DNA、蛋白等相互作用研究，可以讓我們?nèi)媪私饪拱C(jī)理，進(jìn)而在未來(lái)設(shè)計(jì)高效低毒配合物時(shí)避免不利因素[10]。本文合成了2種單核芳基釕聯(lián)吡啶衍生物配合物[Ru(η6-p-cymene)(L1)Cl]Cl(1)和[Ru(η6-p-cymene)(L2)Cl]Cl(2)(L1=4，4′-dimethyl-2，2′-bipyridine，L2=4′-methyl-(2，2′-bipyridine)-4-carbaldehyde oxime)，通過(guò)元素分析、ESI-MS和1H NMR進(jìn)行了表征。用MTT法測(cè)試了配體及配合物對(duì)癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的毒性，并用紫外光譜法和熒光光譜法研究了配合物與DNA、BSA的作用。在上述結(jié)果基礎(chǔ)上探討了影響配合物抗癌活性的因素，將為研究新藥物、新靶點(diǎn)、新機(jī)制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用溶劑均采用分析純?cè)噭?，根?jù)實(shí)驗(yàn)需要，試劑在使用前均按照《實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品純化手冊(cè)(第五版)》[16]進(jìn)行純化。所有的反應(yīng)均在氬氣保護(hù)氛圍下進(jìn)行。 4，4′-dimethyl-2，2′-bipyridine(L1)購(gòu)自晚晴化學(xué)品公司。根據(jù)文獻(xiàn)方法[12-13]制備了配體4′-methyl-(2，2′-bipyridine)-4-carbaldehyde oxime(L2)。除特殊要求，所有測(cè)試均在室溫下進(jìn)行。1H NMR采用Bruker AVANCE 400 spectrometer(德國(guó))測(cè)定，C、H、N元素分析使用元素分析儀(vario ELⅢ，賀力氏公司，德國(guó))測(cè)定，ESI-MS使用LCQ FLEET電噴霧質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技，美國(guó))測(cè)定(Source Voltage 4.0 kV，Sheath Gas Flow Rate 8 arb，Capillary Voltage 70 V，Capillary Temp 275 K，流動(dòng)相為甲醇，流速為200 pL·min-1，進(jìn)樣方式為直接進(jìn)樣，樣品配成甲醇溶液)，紫外吸收分光光譜儀為美國(guó)瓦里安公司生產(chǎn)的Cary 50儀器，熒光光譜是用PerkinElmer Ls-55熒光光譜儀測(cè)定。

1.2 配合物的合成與結(jié)構(gòu)

1.2.1 [Ru(η6-p-cymene)(L1)Cl]Cl(1)的合成

芳基釕二聚體[RuCl2(η6-p-cymene)]2(122.4 mg，0.2 mmol)、配體(L1)(73.6 mg，0.4 mmol)溶于 10 mL甲醇中，在氬氣氛圍下，338 K回流12 h。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)柱層析分離，CH2Cl2/MeOH(15∶1，V/V)為洗脫劑,產(chǎn)量為85.2 mg,產(chǎn)率為43.5%。1H NMR(CDCl3,400 MHz)：9.52(2H，d，pyridine)，8.03(2H，s，pyridine)，7.54(2H，d，pyridine)，6.17(2H，d，p-cymene)，6.02(2H，d，p-cymene)，2.70(1H，dt，CH)，2.58(6H，s，CH3)，2.27(3H，s，CH3)，1.06(6H，d，CH3)。ESI-MS：[1-Cl-]+m/z的理論值為454.98，實(shí)驗(yàn)值為455.25。元素分析(%)：C22H26N2RuCl2的理論值為 C 53.88，H 5.34，N 5.71；實(shí)測(cè)值為 C 53.28，H 5.28，N 5.86。

1.2.2 [Ru(η6-p-cymene)(L2)Cl]Cl(2)的合成

將芳基釕二聚體[RuCl2(η6-p-cymene)]2(122.4 mg，0.2 mmol)、配體 L2(85.6 mg，0.4 mmol)溶于甲醇中，在氬氣氛圍下，338 K回流12 h。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)柱層析分離，CH2Cl2/MeOH(10∶1，V/V)為洗脫劑，產(chǎn)量為83.7 mg，產(chǎn)率為40.3%。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.41(1H，s，OH)，9.50(1H，t，pyridine)，9.38(1H，dd，pyridine)，8.70(1H，d，pyridine)，8.53(1H，s,pyridine),8.35(1H,d,pyridine)，7.89(1H，dd，pyridine),7.67(1H,t,CH),6.29～6.19(2H，m，p-cymene)，6.02～5.91(2H，m，p-cymene)，2.62～2.55(4H,m,CH,CH3),2.18(3H,d，CH3)，1.01～0.86(6H，m，CH3)。 ESI-MS：[2-Cl-]+m/z的理論值為483.98，實(shí)驗(yàn)值為484.25。元素分析(%)：C22H25N3ORuCl2的理論值為 C 50.87，H 4.85，N 8.09；實(shí)測(cè)值為 C 49.83，H 5.23，N 7.82。

1.3 配合物的水解

通過(guò)UV-Vis光譜測(cè)定配合物1、2的水解。將配合物溶于DMSO，濃度為2 mmol·L-1，加水稀釋，得濃度為50 μmol·L-1的溶液 (溶劑體積比為VDMSO∶VH2O=5∶95)。 在 298 K 下，于波長(zhǎng) 200～800 nm 范圍用1 cm路徑的石英比色皿測(cè)定，12 h內(nèi)每隔15 min記錄吸光度值。

1.4 配合物與CT-DNA的相互作用

將 CT-DNA配制在磷酸鹽緩沖液(PBS，5 mmol·L-1，pH 7.0)中，儲(chǔ)存在 269 K 溫度下。 用 PBS適當(dāng)稀釋后，通過(guò)UV-Vis在波長(zhǎng)為260 nm處用1 cm路徑的石英比色皿測(cè)量吸光度值，確定CT-DNA的濃度(ε=6 600 L·mol-1·cm-1)。紫外吸光強(qiáng)度的比值(A260/A280)約為1.9，表明DNA溶液不含蛋白質(zhì)。滴定實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，用雙通道進(jìn)行測(cè)試，以相應(yīng)濃度的CT-DNA作為空白對(duì)照。將50 μmol· L-1配合物溶液置于1 cm路徑的石英比色皿中保持濃度不變，加入等體積的0.5 μL CT-DNA儲(chǔ)備溶液，CTDNA與配合物的濃度比例CT-DNA與配合物的濃度比例 r 依次為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，CT-DNA 的 濃 度 分 別 為 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol·L-1。CT-DNA 與配合物混合7 min以達(dá)到平衡，于200～800 nm范圍記錄吸光度值。

1.5 配合物與血清白蛋白的相互作用

稱取2 mg BSA，用pH=7.4的PBS溶解，加緩沖液稀釋，配制濃度為3 μmol·L-1的BSA溶液。將配合物溶于DMSO，使配合物的初始濃度為10 mmol·L-1，將配合物用pH=7.4的PBS稀釋至1.5 mmol·L-1，滴定實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，將 3 μmol·L-1的BSA溶液置于1 cm路徑的石英比色皿中，加入等體積的0.5 μL配合物溶液，配合物與BSA的比例r依次為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，配合物的濃度 分 別 為 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5 μmol·L-1。混合10 min達(dá)到平衡后，于樣品的激發(fā)波長(zhǎng)285 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞毒性研究

實(shí)驗(yàn)選取了3種細(xì)胞系：人卵巢癌細(xì)胞(A2780)，肺癌細(xì)胞(A549)和正常肝臟細(xì)胞(L02)，來(lái)源于中山大學(xué)(中國(guó)，廣州)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。細(xì)胞在含10%的血清培養(yǎng)基RPMI1640(Gibco BRL)中37℃培養(yǎng)。配合物對(duì)癌細(xì)胞體外抗增殖活性試驗(yàn)方法為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104CFU·mL-1，每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，預(yù)培養(yǎng)24 h。分別設(shè)空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組以及 4 個(gè)濃度(12.5、25、50、100 μmol·L-1)配合物藥物組，孵育48 h。然后向每個(gè)孔中加入20 μL噻唑藍(lán)(MTT，5 mg·mL-1，以 PBS 溶解)，37 ℃培養(yǎng) 4 h。小心地除去培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入150 μL DMSO以溶解甲瓚晶體，避光放置30 min。使用酶標(biāo)儀(Infinite M200，Tecan，Mannedorf，瑞士)測(cè)定 590 nm處的吸光度。計(jì)算配合物對(duì)癌細(xì)胞增殖(48 h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)[17-18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞毒性研究

采用MTT法測(cè)定了配體L1和L2及配合物1、2對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)、人卵巢癌細(xì)胞(A2780)和正常肝臟細(xì)胞(L02)細(xì)胞毒性(IC50)。由配合物IC50結(jié)果(表1)可以看出，配體L1和L2對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)有較強(qiáng)的毒性，其中 L1 的細(xì)胞毒性(11.83 μmol·L-1)優(yōu)于臨床使用的抗癌藥物順鉑(13.84 μmol·L-1)，但他們對(duì)正常細(xì)胞毒性很小(＞100 μmol·L-1)。配合物 1 和 2對(duì)癌細(xì)胞A2780、A549和正常細(xì)胞L02基本沒有毒性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于順鉑的毒性。從上述結(jié)果可以看出，與對(duì)-傘花烴釕配位后，配合物1、2對(duì)癌細(xì)胞及正常肝臟細(xì)胞的毒性急劇降低(～200 μmol·L-1)。 為了探究造成配合物抗癌活性降低的原因，我們研究了配合物的水解及其與蛋白、DNA的相互作用。

表1 配體L1、L2及配合物1、2和順鉑的細(xì)胞毒性（IC50）Table 1 Cell toxicity of L1,L2 and complexes 1,2 and cisplatin （IC50）μmol·L-1

2.2 配合物的水解

配合物的水解化學(xué)可以調(diào)控它們的藥理學(xué)性質(zhì)，包括細(xì)胞攝取、分布、與DNA結(jié)合、體內(nèi)代謝和毒性等[19-20]。通過(guò)紫外吸收光譜研究了1、2的水解(圖1)。配合物1在250 nm處有一肩峰，264 nm處有較強(qiáng)的吸收峰可歸屬為混合LLCT/MLCT(配體ππ*/中心金屬d軌道上的電子向配體π*軌道的躍遷)躍遷，在304和314 nm處的較強(qiáng)吸收峰歸屬為L(zhǎng)LCT躍遷；配合物2在250和280 nm處的較強(qiáng)吸收峰可歸屬為混合LLCT/MLCT躍遷，320 nm處較弱的吸收峰可歸屬為L(zhǎng)LCT躍遷[21]。2個(gè)配合物的水解都是離去基團(tuán)Cl-與H2O發(fā)生交換，有新物質(zhì)生成，產(chǎn)物濃度的升高會(huì)導(dǎo)致吸收峰增強(qiáng)，而配合物濃度的降低則導(dǎo)致吸收峰減弱。配合物1水解時(shí)的吸收峰強(qiáng)度隨著時(shí)間變化很小，最大吸收峰處的吸光度略微增加(從0.551增加到0.557)，說(shuō)明1在水溶液中比較穩(wěn)定，。配合物2水解時(shí)的吸收峰強(qiáng)度隨時(shí)間變化比較明顯，280 nm吸收峰處的吸光度有較大增加(從0.716升至0.759)。上述結(jié)果說(shuō)明2個(gè)配合物水解反應(yīng)不同，且配合物1水解速率比2慢。根據(jù)吸光度的變化，按準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[22]計(jì)算出配合物1和2的水解速率常數(shù)分別為0.383和1.458 h-1，半衰期分別為 1.81 和 0.47 h(表 2)，與文獻(xiàn)報(bào)道[22]的水解方式一樣。

配合物1、2的水解反應(yīng)的速率不同可能與其聯(lián)吡啶螯合配體有關(guān)，配體L1和L2的取代基分別為-CH3和-CHNOH，-CHNOH為親水基團(tuán)，能增加配合物2的溶解度。

表2 配合物1和2的水解常數(shù)Table 2 Hydrolysis constant of complexes 1,2

圖1 配合物1(a)和2(b)在DMSO溶液中的紫外吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of complexes 1(a)and 2(b)in the DMSO solution

2.3 配合物與CT-DNA的相互作用

芳基釕配合物在細(xì)胞中的可能靶點(diǎn)是DNA，研究DNA和金屬配合物之間的相互作用在抗癌機(jī)制中至關(guān)重要[23-24]。當(dāng)配合物與DNA發(fā)生作用時(shí)，紫外光譜吸收峰會(huì)表現(xiàn)出減色現(xiàn)象，減色越明顯表明配合物與DNA相互作用越強(qiáng)[25]。通過(guò)紫外光譜法研究了配合物1、2與DNA相互作用。在200～600 nm范圍測(cè)定配合物1、2與CT-DNA作用的吸收光譜(圖2)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 1在250、263、304及 314 nm處有吸收，最強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在250和263 nm。配合物2在250、280及314 nm處有吸收，最強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在250和280 nm。1和2的紫外吸收強(qiáng)度隨著DNA濃度的增加出現(xiàn)減色效應(yīng)。配合物1和2的△A分別為0.05和0.1，減色百分比分別為8.3%和12.3%。2的減色效果強(qiáng)于1，出現(xiàn)這種差異的原因可能是聯(lián)吡啶的取代基不一樣[26]。配合物通過(guò)嵌入作用與DNA結(jié)合后與堿基對(duì)發(fā)生π電子堆積，配體的π*空軌道與DNA堿基對(duì)的π軌道發(fā)生偶合導(dǎo)致能級(jí)下降，偶合后的π*軌道部分填充電子，使其π-π*躍遷幾率減小，從而產(chǎn)生減色效應(yīng)[27]。上述結(jié)果表明配合物可能通過(guò)嵌入作用與雙鏈CT-DNA結(jié)合。Schatzschneider等發(fā)現(xiàn)釕配合物紫外吸收峰波長(zhǎng)的改變與聯(lián)吡啶配體上的取代基有關(guān)，取代基會(huì)影響配體的π-π*的躍遷，取代基為吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)使π-π*躍遷更容易[25]。配合物1和2中聯(lián)吡啶配體上的取代基分別為-CH3和-CHNOH，-CHNOH為吸電子基，所以2的減色效果明顯。

在紫外滴定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用以下公式計(jì)算了配合物 1和 2與 DNA 的結(jié)合常數(shù) Kb：CDNA/(εa-εf)=CDNA/(εb-εf)+1/Kb(εb-εf)其中 εa是表觀吸收系數(shù)，根據(jù)朗博-比爾定律，應(yīng)為A/(bC)，εb是完全結(jié)合DNA的消光系數(shù)，εf是沒有加DNA時(shí)配合物的消光系數(shù)[28]。計(jì)算得到配合物1、2的結(jié)合常數(shù)分別為7.8×103和 1.86×104L·mol-1，說(shuō)明配合物 2 與 DNA 的結(jié)合能力較強(qiáng)。造成這種差別的原因可能是配體L2的取代基為-CHNOH，-CHNOH是親水基團(tuán)，能增加配合物的溶解度，水解速度快。配合物1、2與DNA結(jié)合常數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果在同一個(gè)數(shù)量級(jí)[29]，也表明配合物與DNA以嵌入方式作用。

圖2 配合物1(a)和2(b)加入DNA前后的紫外吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectra of complex 1(a)and 2(b)in the absence and the presence of CT-DNA

2.4 配合物與蛋白的相互作用

金屬配合物與血清白蛋白BSA結(jié)合的定性分析通常通過(guò)熒光光譜進(jìn)行檢測(cè)。BSA產(chǎn)生熒光的生色團(tuán)是由蛋白質(zhì)的2個(gè)氨基酸引起的，即色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)。蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換，底物結(jié)合或變性反應(yīng)都有可能導(dǎo)致色氨酸的發(fā)射光譜發(fā)生變化[30]。BSA的固有熒光可以提供關(guān)于其結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的信息，并且常用于蛋白質(zhì)折疊和相關(guān)反應(yīng)的研究[31]。配合物與BSA滴定實(shí)驗(yàn)的熒光發(fā)射光譜如圖3(a)、3(b)所示。配合物1、2加入到BSA溶液中導(dǎo)致其在348 nm處的熒光強(qiáng)度的顯著降低，分別降低了44.9%和31.8%(圖4)，說(shuō)明配合物與血清白蛋白有較強(qiáng)的相互作用，且配合物1與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力強(qiáng)于2。熒光強(qiáng)度的變化可以用Stern-Volmer方程[32]描述：I0/I=1+kqτ0CQ=1+KsvCQ；其中 I0和 I分別是只有BSA時(shí)和猝滅劑(配合物)、BSA共存時(shí)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度，kq是Stern-Volmer淬滅常數(shù)，Ksv是動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為熒光團(tuán)的熒光壽命，其平均壽命大約為10-8s，CQ為猝滅劑的濃度。根據(jù)此方程計(jì)算得到了配合物1和2的Ksv和kq。2個(gè)配合物的 kq分別為(7.50±0.47)×1012、(5.00±0.43)×1012L·mol-1·s-1(表3)，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·s-1)[32-33]，說(shuō)明動(dòng)態(tài)碰撞不是引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因，而是由于配合物和 BSA形成了不發(fā)光的加合物，從而引起了BSA內(nèi)源熒光的靜態(tài)猝滅。配合物1和2的Ksv值分別為(7.50±0.47)×104、(5.00±0.43)×104L·mol-1(表3)，也說(shuō)明配合物能與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，且配合物1與蛋白質(zhì)的作用強(qiáng)于2。

圖3 BSA溶液中加入配合物1(a)和2(b)的熒光光譜Fig.3 Emission spectra of BSA in the absence and presence of increasing amount of complexes 1(a)and 2(b)

圖4 BSA加入不同濃度的配合物1和2時(shí)的熒光強(qiáng)度變化Fig.4 Fluorescence intensity variation of BSA-bound complexes 1 and 2

假設(shè)蛋白質(zhì)上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù) Scatchard 方程：Δ(I/I0)/CQ=nKA-KAΔ(I/I0)(CQ是猝滅劑即配合物的濃度)，以 Δ(I/I0)/CQ對(duì) Δ(I/I0)作圖，根據(jù)截距和斜率分別可以求得配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(表3)，配合物 1、2的結(jié)合常數(shù)分別為(1.04±0.03)×105和(8.62±0.71)×104L·mol-1。這表明配合物與BSA有很強(qiáng)的相互作用，其中配合物1的作用較強(qiáng)。配合物與BSA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，即配合物與BSA分子存在1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。BSA主要有2個(gè)色氨酸殘基發(fā)射內(nèi)源熒光，一個(gè)是位于分子內(nèi)部疏水腔的Trp-212；另一個(gè)是位于分子表面的Trp-134。由于Trp-134暴露在親水環(huán)境會(huì)發(fā)生猝滅，所以BSA分子的內(nèi)源熒光主要由處于疏水腔的Trp-212產(chǎn)生[34-35]。因此，可以推斷引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因主要是配合物導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響了Trp-212的疏水環(huán)境[36]。

血清白蛋白能夠運(yùn)輸金屬離子和金屬配合物，它們之間相互作用可能增強(qiáng)或減弱配合物的生物特性和改變藥物運(yùn)輸通路。如果配合物與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)KA太高，配合物就無(wú)法從血清白蛋白中釋放進(jìn)入靶細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性降低[36]。配合物1和2與血清白蛋白的作用強(qiáng)于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[37]，引起配合物的細(xì)胞毒性降低。其中配合物1的結(jié)合能力較強(qiáng)，造成這種差別的原因可能是配體L1的取代基為-CH3，-CH3是疏水基團(tuán)，疏水基團(tuán)可能進(jìn)入BSA的疏水腔,與BSA分子以疏水作用方式結(jié)合,從而使色氨酸周圍疏水性增加,引起蛋白分子的結(jié)合位點(diǎn)間相互作用[36]。

表3 配合物1和2對(duì)BSA的Stern-Volmer熒光猝滅數(shù)據(jù)Table 3 Stern-Volmer fluorescence quenching data of BSA in the complexes 1 and 2

3 結(jié) 論

利用雙齒螯合結(jié)構(gòu)的聯(lián)吡啶類配體和芳基釕二聚體[RuCl2(η6-p-cymene)]2合成了單核配合物1和2，并探討了影響其抗癌活性的因素。配合物2的水解反應(yīng)速率比1快；1、2都能與DNA結(jié)合但配合物2的結(jié)合能力較強(qiáng)。配合物與蛋白的較強(qiáng)結(jié)合能力，可能是其細(xì)胞毒性不高的原因。配合物1的較慢水解速度有利于提高抗癌活性，其與蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)，通過(guò)蛋白輸送進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)水解進(jìn)攻可能的靶標(biāo)DNA；配合物2有可能在與蛋白結(jié)合之前已水解而與蛋白結(jié)合，沒有到達(dá)靶標(biāo)。上述結(jié)果可能是導(dǎo)致2個(gè)配合物抗癌活性略有不同的原因。因此，配合物的水解、與DNA和蛋白的作用可能是影響抗癌活性的主要原因。這些結(jié)果為未來(lái)設(shè)計(jì)新型高效的芳基釕抗癌藥物將提供指導(dǎo)作用。

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