史晨燕，李浩鵬，劉睿媛，耿會玲

(西北農(nóng)林科技大學 化學與藥學院，陜西 楊陵 712100)

香豆素是一類具有α-苯并吡喃酮結構的天然產(chǎn)物，其廣泛分布于傘形科、蕓香科、?？频雀叩戎参锛拔⑸锎x產(chǎn)物中[1]，不僅是藥用植物的主要活性成分之一，而且具有豐富多樣的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗HIV、抗炎、抗癌、抗凝血等[2-5]。此外，該類化合物也被廣泛應用于熒光染料、激光染料、熒光增白劑、發(fā)光材料、熒光探針及非線性光學材料等[6-7]領域。1978年，M.Berenbaum[8]首次報道了花椒毒素這一典型香豆素對植食性昆蟲的光活化毒性，引起了人們對天然香豆素在農(nóng)作物病菌和害蟲防治方面研究的關注。蛇床子素不僅對常見農(nóng)作物的植物病原真菌具有廣譜抑制活性[9-12]，還對菜青蟲、小菜蛾幼蟲等害蟲具有觸殺作用[13]，是香豆素類化合物在農(nóng)業(yè)上成功應用的典范。此后，掀起了從香豆素類化合物中篩選“低毒、高效、低殘留”生物農(nóng)藥的熱潮。但天然香豆素在植物中含量較低，無法滿足市場需求，限制了它們的廣泛應用，因此，借助化學合成實現(xiàn)其規(guī)?；a(chǎn)。該類化合物的經(jīng)典合成方法有Perkin反應、Wittig反應、Pechmann反應等[14-16]，近年來又發(fā)展了Mukaiyama酯化反應、多米諾反應、微波輔助法等簡潔、高效、綠色的新合成方法[17-19]。

本研究以取代水楊醛即鄰羥基苯甲醛為原料，在有機堿催化下[20]，采用改進的Knoevenagel縮合法合成了15種3-香豆素甲酸乙酯類化合物，并測定其對12種常見植物病原真菌的抑制活性，為香豆素類抗菌素的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試的馬鈴薯干腐(Fusariumsolani,縮寫為FS)、蘋果輪紋(Botryosphaeriadothidea,縮寫為BD)、玉米彎孢(Curvularialunata,縮寫為CL)、棉花枯萎(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum,縮寫為FOV)、蘋果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides,縮寫為CG)、蘋果腐爛(Valsamali,縮寫為VM)、西瓜枯萎(Fusariumoxysporumsp.niveum,縮寫為FON)、小麥赤霉(Fusariumgraminearum,縮寫為FG)、白菜黑斑(Alternariabrassicae,縮寫為AB)、煙草赤星(Alternariaalternate,縮寫為AA)、南瓜枯萎(Fusariumbulbigenum,縮寫為FB)和水稻稻瘟菌(Pyriculariaoryza,縮寫為PO)等12種植物病原真菌均由西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究中心提供。

1.1.2 儀器與試劑 XT-4顯微熔點儀(溫度計未校正，北京泰克儀器有限公司)，Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司)，F(xiàn)innigan Trace質(zhì)譜儀(美國Themo Finnigan公司)。

醚菌酯(Kresoxim-methyl，縮寫為KM，≥99%)，阿拉丁試劑股份有限公司；DMSO，成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖，廣東光華科技股份有限公司；取代水楊醛，北京伊諾凱試劑公司；醫(yī)用酒精、丙二酸二乙酯、哌啶、無水乙醇等均為市售分析純試劑。

1.2 目標化合物的合成

以哌啶為催化劑，使取代鄰羥基苯甲醛(取代水楊醛)與含有活潑亞甲基的丙二酸二乙酯在無水乙醇中發(fā)生縮合反應，得到取代3-香豆素甲酸乙酯A1～A15，合成路線見圖1。

圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route for the target compounds

以化合物A1即3-香豆素甲酸乙酯的合成為例[21]：向干燥的圓底燒瓶中依次加入水楊醛(4.9 g,4.3 mL,40 mmol)、丙二酸二乙酯(7.25 g,6.8 mL,45 mmol)、25 mL無水乙醇、0.5 mL哌啶和1～2滴冰醋酸，裝上冷凝管和干燥管后加熱至回流；TLC跟蹤檢測，2 h后反應完全。待反應液冷卻至室溫后轉入錐形瓶內(nèi)，向其中加入3～5 mL水，冰水浴冷卻使產(chǎn)物完全析出；減壓抽濾，產(chǎn)物用冷卻的50%乙醇洗滌2次(每次3～5 mL)，抽干，得白色晶體。用乙醇∶水=1∶3(v∶v)重結晶，稱重，得7.3 g產(chǎn)物，產(chǎn)率為83.4%。以相應的取代水楊醛為原料，采用相同的方法合成A2～A15。

1.3 結構表征

用顯微熔點儀測定了化合物A1～A15的熔點，采用質(zhì)譜(ESI-MS)和核磁共振譜(1H NMR、13C NMR)對其結構進行了表征。

1.4 體外抗菌活性測定

采用菌絲線性生長速率法測定了所有化合物對馬鈴薯干腐、蘋果輪紋、玉米彎孢等12種植物病原真菌的抑制活性[22-25]。以50 μg·mL-1的醚菌酯溶液為陽性對照，以5%的DMSO水溶液作為空白對照，將已準確稱量的待測化合物完全溶于5%(v/v)的DMSO水溶液中，將10 mL待測液或?qū)φ找号c90 mL無菌PDA培養(yǎng)基在50℃快速混勻，得到濃度為50 μg·mL-1的含藥液；將其趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10 mL，冷卻備用。把供試病原菌(菌餅直徑5 mm)接種到上述培養(yǎng)皿中，每個測試組設3個平行；將其置于濕度為60%、28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，采用十字交叉法測量菌落直徑(mm)，按式(1)計算菌絲生長抑制率(inhibition rate,IR)：

IR(%)=[(dc-d0)-(ds-d0)]/(dc-d0)×100

(1)

式中：d0為菌餅直徑(5 mm)，dc為空白對照組菌落平均直徑，ds為樣品組菌落平均直徑(mm)。

設7個濃度，采用相同方法測定A6及陽性對照的EC50值。

2 結果與分析

2.1 3-香豆素甲酸乙酯類化合物的結構表征

采用上述方法合成了15種3-香豆素甲酸乙酯類化合物(A1～A15)，其物理性質(zhì)和質(zhì)譜(ESI-MS)數(shù)據(jù)見表1，核磁共振氫譜和碳譜(1H NMR和13C NMR)數(shù)據(jù)見表2。

由表2可知：在1H NMR譜中，所有化合物在δH8.49～8.96范圍內(nèi)都出現(xiàn)單峰，這是4號碳上氫原子的信號峰。此外，A系列化合物在δH4.45～4.36范圍內(nèi)均出現(xiàn)4重峰，這是乙基中亞甲基上的氫信號；在δH1.43～1.39范圍內(nèi)出現(xiàn)3重峰，這是乙基中甲基上的氫信號；它們的耦合常數(shù)均為7.1 Hz。在13C NMR譜中，所有化合物在δC162.1～165.1和δC154.6～161.9范圍內(nèi)出現(xiàn)2個酯羰基信號峰。

表1目標化合物的物理性質(zhì)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)
Table 1 Physical properties and ESI-MS data of the target compounds

化合物取代基R熔點/℃物態(tài)(室溫)CAS號收率質(zhì)譜ESI-MS m/z預測值測量值A1H89.0～92.7白色晶體1846-76-083218.21219.02 [M+H]+A28-CH342.3～43.6黃色固體17349-63-285232.24255.09 [M+Na]+A37-CH375.1～76.5黃色固體327613-94-588232.24255.17 [M+Na]+A46-CH3102.0～104.3淡黃色固體54396-24-688232.24255.13 [M+Na]+A58-OCH387.1～89.3白色固體1729-02-892248.23271.87 [M+Na]A67-OCH3133.6～134.8白色固體6093-72-789248.23271.90 [M+Na]+A76-OCH3139.8～141.0黃色固體41459-71-688248.23271.13 [M+Na]+A88-OH173.3～174.6白色固體108170-58-789234.21490.73 [2M+Na]+A97-OH166.3～167.2淡黃色固體6093-71-687234.21490.77 [2M+Na]+A106-OH184.0～185.8棕色固體70160-51-986234.21490.75 [2M+Na]+A118-F92.5～93.7黃色固體1821196-31-986236.20259.14 [M+Na]+A126-F87.5～88.4淡黃色固體70384-81-590236.20259.20 [M+Na]+A136-Cl159.2～160.5黃色固體70384-80-488252.65274.84 [M+Na]+A146-Br170.2～171.3淡黃色固體2199-90-893297.10616.57 [2M+Na]+A156-NO2198.5～199.3黃色固體13373-28-992263.21550.68 [2M+Na]+

2.2 目標化合物抗菌活性初篩結果

測定了15種目標化合物在50 μg·mL-1時對12種供試菌的體外抑制活性，結果見表3。由表3可知：大多數(shù)目標化合物在50 μg·mL-1對供試菌具有不同程度的抑制活性。相比較而言，供試化合物對蘋果腐爛、蘋果炭疽、蘋果輪紋病原菌的抑制活性較高，說明這3種菌為其敏感菌株。苯環(huán)上引入取代基有助于提高活性，但給電子取代基的化合物的抑菌活性大都高于吸電子取代基者，如7-甲氧基取代的A6對蘋果腐爛病原菌的抑制活性最高，我們采用相同方法測定了其對2種敏感菌的毒力方程和EC50值。

由表4可知：A6對蘋果腐爛病原菌的EC50值(65.4 μg·mL-1)高于陽性對照醚菌酯(84.7 μg·mL-1)，但對蘋果輪紋病原菌的活性遠低于醚菌酯。

3 結論與討論

采用Knoevenagel縮合法實現(xiàn)了目標化合物的合成，通過ES-IMS和NMR譜確認了它們的結構。在母核6/7/8位即苯環(huán)不同位置引入給電子取代基甲基、甲氧基、羥基或吸電子取代基氟、氯、溴和硝基，以豐富3-香豆素甲酸乙酯類化合物并考察不同類型取代基對其抗真菌活性的影響。其初步構效關系為：1)對絕大多數(shù)供試菌而言，無論向苯環(huán)引入吸電子取代基還是給電子取代基，對該類化合物的抗菌活性均有不同程度的提高；2)相比較而言，帶有給電子取代基化合物的抗菌活性基本高于吸電子取代基者，如7-OCH3取代產(chǎn)物A6的活性總體較高，而6-NO2取代產(chǎn)物A15的活性普遍較低；3)對于帶給電子取代基的產(chǎn)物而言，不同取代基對活性的影響順序大致為甲氧基>甲基>羥基；對于同一取代基而言，其活性順序為7位>6位>8位；4)對于吸電子取代基而言，6-NO2取代產(chǎn)物A15的活性大都<鹵素取代產(chǎn)物的活性；5)A6對蘋果腐爛病原菌的活性最高，其EC50值(65.4 μg·mL-1)>陽性對照醚菌酯(84.7 μg·mL-1)。

表2 目標化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)Table 2 The 1H NMR and 13C NMR data of the target compounds

3-香豆素甲酸乙酯類化合物是農(nóng)用抗菌劑家族中的新成員，雖然關于香豆素類化合物的合成及其生物活性的研究已有報道[26-27]，但目前尚沒有對該類化合物抗菌活性的系統(tǒng)研究，母核同一位置的不同取代基對其活性的影響、同一取代基在不同位置對其活性的影響、大位阻取代基對其活性的影響規(guī)律并不清楚，不同類型香豆素的抗菌譜及其作用機制也尚不明確，這有待于我們進一步深入研究。

表3 目標化合物抗真菌活性初測結果(50 μg·mL-1,72 h)Table 3 Results of preliminary antifungal activities of title compounds (50 μg·mL-1,72 h)

表4 化合物A6對部分供試病菌的毒力方程及EC50值Table 4 Toxicity regression equations and EC50 values of A6 against tested fungi μg·mL-1

注：*公式中y:抑制率的幾率值；x:lgC(pg·mL-1)。

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