鄭雅月,楊 璐，張炳慧，趙萬春,2，董 劍,2，高 翔,2，李曉燕,2(.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 7200；2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 7200)

小麥產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量3因素構(gòu)成，其中千粒質(zhì)量在產(chǎn)量構(gòu)成因素中受遺傳特性的影響最大，廣義遺傳力高達(dá)59%～80%[1]。小麥籽粒大小影響千粒質(zhì)量的形成，屬于受多基因控制的數(shù)量性狀[2]。在前人的研究中，利用不同的群體材料，小麥籽粒大小和產(chǎn)量相關(guān)的QTL被鑒定出來。例如，Kumar等[3]將控制粒質(zhì)量的QTL定位在1AS、2BS、7AS上，這些QTL可解釋9.06%～19.85%的表型變異；王瑞霞等[4]在多個環(huán)境下將21個與千粒質(zhì)量相關(guān)的 QTL定位在小麥1A、1B、2A、2D、3B、4A、4D、5A、6D和7D染色體上。這些QTL的鑒定與定位，為小麥籽粒大小基因的精細(xì)定位與克隆奠定了很好的前期基礎(chǔ)。

目前，對于小麥籽粒大小相關(guān)基因的克隆已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。Song等[5]研究發(fā)現(xiàn)，水稻粒寬基因(OsGW2)的同源基因TaGW2通過控制種子發(fā)育影響千粒質(zhì)量。常成等[6]在小麥中克隆了水稻GS3的同源基因PEBP-like基因，發(fā)現(xiàn)PEBP-like基因的變異對籽粒的大小以及粒質(zhì)量產(chǎn)生影響。Wang等[7]克隆了水稻籽粒大小基因OsGS5的同源基因TaGS5，TaGS5-A1與粒寬、粒質(zhì)量相關(guān)，TaGS5-A1b等位基因在種子發(fā)育的各個時期其表達(dá)量均高于TaGS5-A1a。在水稻中，許多與種子大小相關(guān)的基因已經(jīng)被克隆和功能研究；但在小麥中種子大小相關(guān)基因的功能研究還未深入，小麥籽粒大小形成缺乏相應(yīng)的分子證據(jù)。因此，對小麥籽粒大小相關(guān)基因進(jìn)行克隆，并對這些基因如何調(diào)控小麥籽粒大小的形成進(jìn)行解析，是闡釋小麥籽粒大小形成的分子機制的重要前提。

細(xì)胞色素P450(Cytochromes P450)是植物中最大的蛋白家族之一[8]。對細(xì)胞色素P450的研究發(fā)現(xiàn)，CYP78A家族成員具有控制籽粒大小的功能[9-13]。擬南芥中CYP78A5/KLUH基因控制種子的大小，其作用獨立于其他母系因素，通過促進(jìn)種皮細(xì)胞增殖而決定種子大小[9]。擬南芥中CYP78A9基因也是通過控制胚珠和種子發(fā)育階段表皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而控制種子表皮的大小，影響種子的大小[13]。在水稻中CYP78A13通過調(diào)節(jié)胚與胚乳之間的大小平衡來調(diào)節(jié)種子的大小，CYP78A13基因功能缺失突變體的種子胚增大但胚乳減小，而過表達(dá)CYP78A13則會導(dǎo)致種子的胚減小和胚乳增大[12,14]；番茄中CYP78A5/KLUH的同源基因SlKLUH也通過增加細(xì)胞數(shù)量調(diào)控果實大小[15-17]。前人通過遺傳和蛋白結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為CYP78A家族成員之間具有相似功能，然而，小麥中關(guān)于CYP78A5的功能研究報道還比較少，CYP78A5基因在小麥中對種子生長發(fā)育的調(diào)控機理還未被揭示。本研究通過克隆小麥不同籽粒大小材料中CYP78A5基因，分析TaCYP78A5在大粒小麥‘P271’和小粒小麥‘中國春’(‘CS’)序列變異，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究其在小麥種子大小形成中的作用，為小麥中細(xì)胞色素P450基因調(diào)控種子大小提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥大粒材料‘P271’和小粒材料‘中國春’(‘CS’)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥品質(zhì)遺傳育種實驗室提供(圖1)。將‘中國春’和‘P271’小麥種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的次氯酸鈉消毒，然后利用體積分?jǐn)?shù)1%的H2O2溶液催芽處理后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周后，取幼嫩的葉片提取DNA。2016年10月，‘中國春’和‘P271’按常規(guī)方法種植在楊凌小麥綜合試驗站實驗田，進(jìn)行常規(guī)播種與田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 籽粒表型測定 籽粒的粒長、粒寬、千粒質(zhì)量均由萬深SC-A型種子自動考種儀千粒質(zhì)量儀測定，表1所示的數(shù)據(jù)結(jié)果是284?！袊骸蚜：?85?！甈271’籽粒經(jīng)儀器測量和軟件處理所得。

1.2.2 總DNA提取 采用CTAB法[18]提取小麥葉片基因組總DNA。

1.2.3 引物設(shè)計和基因克隆 根據(jù)NCBI中已公布的基因序列號KT266824.1，采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物TaCYP78A5-F和TaCYP78A5-R，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以‘中國春’和‘P271’幼苗中提取的DNA為模板，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按2×EsTaqMasterMix (CWBIO)說明書配制反應(yīng)體系25.0 μL，含2×TaqMasterMix 12.5 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2.0 μL、DNA 2.0 μL、ddH2O 6.5 μL。擴(kuò)增程序為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目標(biāo)產(chǎn)物，將目的片段與克隆載體PEASY-T1(TransGen Biotech)連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Transl-T1中，篩選陽性單克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4TaCYP78A5基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI中BLAST在線軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRA)進(jìn)行基因序列比對分析，利用NCBI中ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測序列開放閱讀框，利用DNAMAN 7.0進(jìn)行基因序列及蛋白質(zhì)序列比對，在NCBI中CDD(http s:// www. ncbi . nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)在線預(yù)測氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域，利用ProtParam進(jìn)行蛋白質(zhì)一級序列分析(http://web.expasy.org/protparam/)，利用NPS@網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/ repository)預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。利用pfam預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)，利用TMHMM預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)。利用CYP78A5基因全長及其推導(dǎo)的氨基酸序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫查找其同源序列，發(fā)現(xiàn)近緣物種中已克隆CYP78A家族的基因序列，通過MEGA 5.0的最大似然法(Maximum Likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒表型變異

利用自動考種儀千粒質(zhì)量儀測量‘中國春’和‘P271’種子。經(jīng)過儀器自帶的軟件處理得出‘中國春’籽粒的平均寬度為2.59 mm，平均長度為5.32 mm，千粒質(zhì)量為27.68 g，而‘P271’籽粒的平均寬度3.54 mm，平均長度為7.59 mm，千粒質(zhì)量為57.48 g，‘P271’的籽粒長、寬、千粒質(zhì)量都明顯高于‘中國春’(表 1)。因此，本試驗將‘中國春’作為小粒材料，‘P271’作為大粒材料研究TaCYP78A5基因與小麥籽粒大小形成的關(guān)系。

圖1 小麥‘CS’和‘P271’的籽粒粒型

表1 ‘CS’和‘P271’籽粒的表型數(shù)值

2.2 TaCYP78A5基因克隆和序列分析

以特異性引物TaCYP78A5-F:TCTTTCCATGGTTACCGGCC和TaCYP78A5-R:CAG- CTCTCTCTGGCCCTAG擴(kuò)增得到‘中國春’和‘P271’的TaCYP78A5基因序列各18個，這18條序列聚集成3類，將3類序列提交到小麥資源庫(https://urgi.versailles.inra.fr /blast/blast.php)進(jìn)行BLAST比對，分別定位到小麥2AS、2BS、2DS染色體上，命名為TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D。將TaCYP78A5基因的氨基酸序列在NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果顯示TaCYP78A5屬于細(xì)胞色素P450家族成員(圖2-A)。利用NCBI中ORF Finder預(yù)測序列開放閱讀框，TaCYP78A5與其他CYP78A家族成員一樣均由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，不同染色體上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D序列之間顯示出98.17%的高度相似性。TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D的編碼區(qū)長度分別為1 608、1 638和1 650 bp，編碼534、544、549個氨基酸(圖2-B)。

2.3 TaCYP78A5的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Protparam網(wǎng)站進(jìn)行TaCYP78A5蛋白質(zhì)3個染色體組上序列一級序列理化性質(zhì)預(yù)測如表2，結(jié)果顯示蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40，親水性均為正值，說明TaCYP78A5蛋白可能是不穩(wěn)定的脂溶性疏水蛋白，且3條染色體上的結(jié)果相一致。利用NPS@的SOPMA網(wǎng)站預(yù)測TaCYP78A5蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)，以TaCYP78A5-2A為例，如圖3-A中的預(yù)測結(jié)果表明，α-螺旋比例最高，達(dá)到49.63%左右；29.96%左右為無規(guī)則卷曲；伸展鏈的比例在12.55%，β-轉(zhuǎn)角最少，約占7.87%。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，該蛋白主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，含少量β-轉(zhuǎn)角。TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D的二級結(jié)構(gòu)組成與TaCYP78A5-2A相似度很高，TaCYP78-A5-2B蛋白的α-螺旋、無規(guī)則卷曲、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角分別各占47.79%、28.86%、14.15%、9.19%。TaCYP78A5-2D蛋白的α-螺旋、無規(guī)則卷曲、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角分別各占45.36%、29.87%、16.76%、8.01%。在SWISS-MODEL網(wǎng)頁提交TaCYP78A5基因的氨基酸序列，在蛋白結(jié)構(gòu)庫中搜索比對模板，得到4i8v.1.A序列與TaCYP78A5氨基酸序列的第48～544個殘基的一致性達(dá)28%，且4i8v.1.A序列編碼蛋白也是P450家族蛋白，具備同源建模的條件。從而得到本研究中TaCYP78A5-2A基因所編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型如圖3-B，TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D蛋白的三級結(jié)構(gòu)組成與TaCYP78A5-2A相似度很高，都是由α-螺旋和兩個反向平行的β-折疊及一對β-轉(zhuǎn)角組成。將TaCYP78A5編碼的蛋白氨基酸序列輸入TMHMM網(wǎng)址進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析，跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果分析表明該蛋白是膜錨定蛋白，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，第 1～8 個氨基酸為膜內(nèi)區(qū)域，第 9～31個氨基酸為跨膜區(qū)域，其余的均為膜外區(qū)域。Pfam的預(yù)測結(jié)果(圖3-C)也表明第 1～44 個氨基酸為信號肽區(qū)域，其余的為與數(shù)據(jù)庫比對到的P450家族的序列區(qū)域，由此推測TaCYP78A5是一種分泌蛋白。

A.TaCYP78A5基因蛋白家族預(yù)測 Proteins prediction ofTaCYP78A5；B.不同植物中CYP78A5氨基酸序列比對，深藍(lán)色區(qū)域為保守結(jié)構(gòu)域 Alignment of amino acid sequence of CYP78A5 in different plants,the dark blue regions are conserved domain

圖2 小麥CYP78A5蛋白家族預(yù)測及推測的氨基酸序列與其他植物的CYP78A5氨基酸序列比對

A.TaCYP78A5-2A蛋白的二級結(jié)構(gòu)，藍(lán)色區(qū)域為α-螺旋，紫色區(qū)域為無規(guī)卷曲，紅色區(qū)域為伸展鏈，綠色區(qū)域為β-轉(zhuǎn)角 Secondary structure of TaCYP78A5-2A protein,blue area shows alpha helix,purple region as a random coil,the red area is extended strand,the green area is beta turn；B.TaCYP78A5-2A蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Predicted tertiary structure of TaCYP78A5 protein；C.TaCYP78A5序列匹配和特征 TaCYP78A5 sequence matches and features

圖3TaCYP78A5的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

Fig.3PredictedstructureofTaCYP78A5protein

2.4 CYP78A基因進(jìn)化分析

根據(jù)TaCYP78A5氨基酸序列與NCBI中的同源序列比對，發(fā)現(xiàn)TaCYP78A5序列與水稻及節(jié)節(jié)麥序列達(dá)到85%的一致性(圖2-B)，其中TaCYP78A5-2D與節(jié)節(jié)麥的CYP78A5-like(GenBank登錄號為XM_020344923)蛋白有很高的一致性(93%)，進(jìn)一步構(gòu)建TaCYP78A5和其他已知CYP78A家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，水稻CYP78A13(GenBank登錄號為AB780362.1)與水稻CYP78A5(GenBank登錄號為XM_015790749)基因聚于一個分支，顯示出更高的一致性(100%)。且CYP78A家族的其他基因如CYP78A11在不同單子葉物種中的相似性都比較高，可以推測CYP78A家族在單子葉植物中的功能相對保守。而且Xu等[14]研究顯示水稻CYP78A13基因能夠在擬南芥中恢復(fù)cyp78a5的缺失表型，這表明CYP78A13和CYP78A5可能是直系同源基因。因此，本研究克隆到的TaCYP78A5基因編碼一個小麥細(xì)胞色素P450蛋白，并且可能是擬南芥CYP78A5的直系同源基因。

3 討 論

在CYP450家族中，CYP78A與其他成員不同，它參與植物種子發(fā)育等植物特異反應(yīng)[9,12]。通過對一個新的CYP78A5基因突變體的表型觀察，證明了CYP78A5基因參與多個生長發(fā)育調(diào)控途徑，包括可能調(diào)控植物體的細(xì)胞增殖以及發(fā)育時期的轉(zhuǎn)換等，而這些調(diào)控途徑又通過CYP78A5這樣的基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而保證植物的正常生長[19]。CYP78A5基因間接調(diào)控赤霉素合成代謝相關(guān)基因[20]，且不直接調(diào)控植物激素如生長素、細(xì)胞分裂素以及油菜素內(nèi)酯等的代謝[19]。

在模式植物擬南芥和水稻中的研究已經(jīng)證明CYP78A基因家族多個成員如CYP78A5，CYP78A9和CYP78A13等均具有控制種子大小的功能[9,13-14]。在擬南芥中，Adamski等[9]發(fā)現(xiàn)了調(diào)控籽粒大小的KLUH/CYP78A5，籽粒中過表達(dá)KLU基因，種子的體積和質(zhì)量都會顯著增加；而當(dāng)該基因功能缺失時，種子的體積和質(zhì)量又會顯著降低；KLU基因在花后的胚珠內(nèi)表皮中表達(dá)，通過促進(jìn)內(nèi)表皮細(xì)胞的增殖，增大表皮細(xì)胞的數(shù)目，從而達(dá)到增大種子表皮的效果，進(jìn)而增加種子的大小和質(zhì)量。在水稻中，CYP78A9和其同源基因CYP78A6、CYP78A8，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖來調(diào)控花器官的生長及種子發(fā)育[13,17]。編碼CYP78A13的GE基因在平衡胚和胚乳大小方面有重要的影響，GE基因功能缺失后，胚變大而胚乳變?。幌喾吹?，CYP78A13蛋白過表達(dá)后，胚變小而胚乳變大，從而導(dǎo)致水稻種子增大[12,14]。而水稻的CYP78A13基因能夠在擬南芥中恢復(fù)cyp78a5的缺失表型，這表明CYP78A13和CYP78A5可能是直系同源基因[14]。

圖4 CYP78A家族進(jìn)化分析

Miyoshi等[21]發(fā)現(xiàn)水稻PLA1/CYP78A11基因通過影響頂端分生組織的細(xì)胞增殖來調(diào)控生殖器官的發(fā)育，但在頂端分生組織未檢測到CYP78A11基因的表達(dá)，CYP78A11基因可能通過非細(xì)胞自制模式控制生殖器官發(fā)育。Anastasiou等[22]僅在擬南芥葉、花器官基部檢測到CYP78A5基因的表達(dá)，其促生作用卻貫穿整個植株；并提出CYP78A5基因可能依賴于一個可以在細(xì)胞間移動的信號，通過非細(xì)胞自制模式促進(jìn)器官生長。相似的，Adamski等[9]發(fā)現(xiàn)，PINO:CYP78A5轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中僅在胚珠中過表達(dá)CYP78A5基因，卻導(dǎo)致擬南芥花器官的增大、花序的伸長，這一現(xiàn)象也支持CYP78A5基因非細(xì)胞自制的作用模式。

本研究克隆的TaCYP78A5與其他CYP78A家族成員一樣均由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，并與水稻中CYP78A5具有很高的相似性。因此，我們可以推測CYP78A5的同源基因TaCYP78A5在小麥中也可能具有在水稻、擬南芥中類似的功能，通過促進(jìn)胚珠和種子發(fā)育階段表皮細(xì)胞增殖來影響種子大小。本研究通過對核酸序列和編碼的氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)‘P271’和‘中國春’克隆到的TaCYP78A5基因序列一致，說明TaCYP78A5基因在這2個粒型的小麥中相對保守。推測TaCYP78A5基因?qū)@2種粒型的小麥的作用可能是通過在小麥‘P271’的根、莖、葉各組織或籽粒發(fā)育過程中基因表達(dá)量較高引起的，也可能是TaCYP78A5基因的啟動子在2個材料中的差異所引起。關(guān)于TaCYP78A5基因在小麥中的具體的分子作用機制還需進(jìn)一步證明。

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