顧 平，周啟星 ，王 鑫，伍躍輝 ，陳 威，張倩茹，龔 起 ，周愛申

（1.黑龍江省環(huán)境監(jiān)測中心站，哈爾濱 150056；2．南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室/天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室，天津 300071；3．中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016；4．黑龍江省環(huán)境應(yīng)急與事故調(diào)查中心，哈爾濱 150090）

多環(huán)芳烴（PAHs）是土壤環(huán)境中普遍存在的一類有機污染物，由于其毒性和潛在的致癌性已受到普遍關(guān)注[1-7]。苯并[a]芘（B[a]P）是一種具有5環(huán)結(jié)構(gòu)的強致癌性PAHs[8-11]，主要存在于石油污染的土壤[12]、煤礦區(qū)和河流中，已被美國環(huán)保局列入優(yōu)先控制的有毒有機污染物黑名單[13]，在其2008年1月公布的28種有毒有機物中，排名第三[14]。有學(xué)者已對B[a]P降解菌做了一些研究，例如：Boonchan等[8]用真菌-微紫青霉菌和細菌-嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌組成的復(fù)合菌群，能利用B[a]P為唯一碳源生長并降解之；Rafin等[9]篩選出一株腐皮鐮孢霉菌，以B[a]P為唯一碳源并進行降解實驗，12 d后的降解率為4%。目前，國內(nèi)公布的降解B[a]P的微生物主要集中在真菌[15-16]。國外的報道也多以真菌為主，如Hadibarata等[17]研究了一株白腐真菌對B[a]P的降解，結(jié)果顯示，在以B[a]P為唯一碳源的情況下，培養(yǎng)30 h后此菌株對B[a]P降解率為38%。由于細菌本身生理特性的多樣性以及對植物的相對安全性，在微生物修復(fù)技術(shù)中比真菌更具有優(yōu)越性，更能適應(yīng)不同的環(huán)境條件[18-19]。因此，獲得高效降解B[a]P的細菌是豐富微生物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是生物刺激和生物強化[20]等技術(shù)的基礎(chǔ)，對高效降解微生物的篩選和降解特性研究，也成為PAHs污染土壤修復(fù)的第一步。為此，本研究以B[a]P為唯一碳源，從長期受石油污染的土壤中篩選優(yōu)勢土著降解菌株，并考察其降解特性，進而對降解特性最佳的一株菌進行菌種鑒定，旨在為今后污染土壤修復(fù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土樣來源

污染土壤采自沈撫污灌區(qū)四方臺大棚南石油污水灌溉多年的蔬菜田的表層土壤（0~20cm）。土壤理化性質(zhì)：pH 6.9，有機質(zhì) 17.95 g·kg-1，全 N 1.32 g·kg-1，全 P 1.39 g·kg-1，速效 K 144.4 mg·kg-1。總 Cd 2.71 mg·kg-1，Cd含量超過國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準GB 15618—1995的農(nóng)業(yè)用地2級標準（pH介于6.7~7.5之間，Cd含量為0.6 mg·kg-1）的 3.5 倍；16 種 PAHs總量為 0.569 mg·kg-1，2~4 環(huán) PAHs含量為 0.462 mg·kg-1，5~6 環(huán) PAHs含量為 0.106 mg·kg-1，B[a]P 含量為 0.041 mg·kg-1。

1.1.2 主要試劑

B[a]P購于北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，純度≥95%；實驗所用其余有機溶劑均購于山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司，氣譜用正己烷為色譜純，其余常用試劑如二氯甲烷、丙酮、正己烷、層析用硅膠（200~300目）均為分析純。

磷酸緩沖溶液：0.02 mol·L-1NaH2PO4，0.02 mol·L-1Na2HPO4，pH 7.0，0.1 MPa，121 ℃，滅菌 20 min[21]。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集馴化培養(yǎng)基：所用碳源為 B[a]P（5 mg·L-1），以丙酮溶液加入。（NH4）2SO42.0 g，KH2PO40.5 g，Na2HPO40.5 g，MgSO40.3 g，酵母膏 0.2 g，水 1000 mL，pH=7.0，121℃，蒸氣滅菌 30 min。

降解用液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，MgSO40.2 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO4·H2O 1.0 g，水 1000 mL，pH7.0，滅菌條件同上，所用碳源為 B[a]P（5 mg·L-1），以丙酮溶液加入。

降解菌選擇性固體培養(yǎng)基：其無機鹽配方同上，瓊脂濃度20 g·L-1。滅菌條件同上。

活化富集培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1000 mL，pH7.0，滅菌條件同上。

1.2 實驗方法

1.2.1 B[a]P降解菌富集分離和篩選

將采集的篩菌土樣充分混合后取1 g，放入裝有50 mL已滅菌的富集馴化培養(yǎng)基的三角瓶中。開始添加 B[a]P 的濃度為 5 mg·L-1，30 ℃、120 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)開始后每8 d轉(zhuǎn)接1次，以20%的接種量接種到新鮮B[a]P富集馴化液體培養(yǎng)基中，如此連續(xù)富集直至培養(yǎng)到溶液呈現(xiàn)明顯的渾濁及顏色變化（此過程約為30 d）。采用梯度稀釋法在不同B[a]P濃度的選擇性固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，經(jīng)5個周期反復(fù)平板劃線分離后，得到8個菌株樣品，分別純化后保存于牛肉膏蛋白胨斜面。

在無菌條件下，將8個待測菌株樣品制成供試菌懸液（方法見1.2.2），分別接入裝有已滅菌的100 mL降解用液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后加入B[a]P的丙酮溶液，使瓶中B[a]P的濃度達5 mg·L-1，同時設(shè)不接菌對照CK，各3個重復(fù)，在30℃、200 r·min-1恒溫下振蕩培養(yǎng)。自接種開始1~10 d每日固定時間取樣，同時測定培養(yǎng)液中殘留B[a]P濃度和OD600值，以便選取降解曲線趨勢最好和降解率最高的菌株作為降解特性研究對象。

1.2.2 菌懸液的制備

將分離純化后的菌種從斜面各挑取一環(huán)接入活化富集培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h（此時處于對數(shù)生長期）后，分別取3 mL菌液于離心管內(nèi)，離心10 min（8000 r·min-1），用磷酸緩沖溶液清洗后離心 15 min（10 000 r·min-1），反復(fù) 3 次，制成一定濃度的菌懸液冷藏備用。以上操作在無菌條件下進行，目的是洗去培養(yǎng)基中的碳源[18]。

1.2.3 菌株BB-1對B[a]P的降解實驗

無菌條件下，將去掉碳源的供試菌懸液10 mL接入B[a]P濃度為5 mg·L-1的三角瓶中。同時設(shè)不接菌對照CK，各3個重復(fù)，每個重復(fù)兩瓶。培養(yǎng)條件及取樣時間同1.2.1，一瓶分析培養(yǎng)液中殘留B[a]P濃度，另一瓶測定OD600值。以時間為橫坐標，以B[a]P含量和OD600為縱坐標畫出曲線。

在上述研究基礎(chǔ)上，分別研究不同pH值和添加不同濃度葡萄糖作為底物對菌株BB-1降解B[a]P的影響。

1.2.4 菌種鑒定

采用16sRNA基因序列分析、革蘭氏染色、形態(tài)觀察法鑒定菌株。其中，16sRNA基因序列分析引物為：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃保溫 10 min。PCR擴增產(chǎn)物用上海生工的UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，DNA測序由大連寶生物公司完成，將測序結(jié)果用Blast軟件同Genbank中DNA序列進行同源性比較。

1.2.5 微生物生長曲線測定

在30℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)并定時定量吸取培養(yǎng)液，采用蛋白核酸測定儀測定其OD600值以表示其微生物生長密度。

1.2.6 B[a]P的測定

B[a]P含量的分析采用GC-FID法。設(shè)備條件：HP-6890，PLUSGC（Version A.03.07）氣相色譜儀，裝有氫火焰檢測器（FID），HP-5毛細管色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25μm）；采用自動進樣方式，進樣口無分流模式，溫度250℃；柱流量1.5 mL·min-1；高純氮氣（99.999%）作載氣；爐溫80℃；氫火焰離子化檢測器（FID）溫度：310℃。B[a]P在 1.3~9.75 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，峰面積呈較好的線性關(guān)系，線性方程為y=10.408x-2.132 4，其中y為峰面積，x為B[a]P濃度，決定系數(shù)R2=0.993 5。

對樣品進行加標回收率測定，加標濃度為5 mg·L-1，回收率測定結(jié)果為93.6%~108.1%，符合100%±25%的規(guī)定，且對空白加標樣品進行7次平行測定，相對標準偏差為4.6%，小于5%，說明該方法可以用于培養(yǎng)液中B[a]P含量的測定。

培養(yǎng)后的樣品瓶從培養(yǎng)箱中取出后立即放入冰箱中（4℃）平衡1 h以上。拿出后分別用移液管均勻取適量移至分液漏斗。然后加入15 mL二氯甲烷，振蕩萃取10 min，靜置后收集有機相，經(jīng)過無水硫酸鈉去水后存于茄形瓶中。向水相中再加入10 mL二氯甲烷，振蕩萃取5 min，同樣過無水硫酸鈉去水，合并2次萃取的有機相，于氮吹儀上將其溶劑蒸至微干。最后用色譜純的正己烷定容至5 mL，立即轉(zhuǎn)移到氣譜進樣瓶中上機測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

平均值之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），顯著性水平為P<0.05，數(shù)據(jù)處理由SPSS 16.0、Excel 2007、Origin 8.0軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離篩選與鑒定

由于降解污染物的巨大潛力，目前，多數(shù)生物修復(fù)工程中應(yīng)用的是土著微生物，而接種的外源微生物在環(huán)境中難以保持較高的活性導(dǎo)致工程菌的應(yīng)用受到較嚴格的限制[22]?；谶@一原則，許多研究人員均采用從污染土壤中篩選PAHs降解菌的策略[23-25]，以獲取大量微生物作為污染土壤生物修復(fù)的基礎(chǔ)。

本研究以沈撫污灌區(qū)長期受石油污染的土壤為篩選降解菌的目標土壤，利用細菌富集液體培養(yǎng)基得到能利用B[a]P的富集液，然后將其涂布于以不同濃度B[a]P為唯一碳源的固體培養(yǎng)基中，分離篩選到8株形態(tài)各異的能利用B[a]P的微生物。為進一步驗證各菌株的降解能力，將其分別接入以B[a]P為唯一碳源的降解用液體培養(yǎng)基中，定時取樣，通過測定培養(yǎng)液中B[a]P殘留率及菌懸液光密度值（OD600），篩選到一株降解B[a]P能力最強的細菌命名為BB-1。顯微鏡下觀察BB-1菌株為芽孢桿狀，革蘭氏染色陽性，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上其菌落為圓形、擴展、邊緣整齊、淡黃色、有光澤。該菌株為好氧化能異養(yǎng)菌。以其總DNA為模板，采用細菌16sRNA基因特異引物F27和R1492進行擴增，獲得1.5 Kb大小的PCR產(chǎn)物，用Blast軟件將該片段測序結(jié)果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株BB-1與Bacillus megaterium同源性為100%。根據(jù)形態(tài)及序列特征，菌株BB-1被鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium），其序列特征見圖1。

圖1 菌株BB-1的16sRNA基因序列Figure1 16sRNAgenesequenceof strain BB-1

目前，PAHs降解菌的研究大多集中在3~4環(huán)有機物上，也達到比較理想的降解效果，如黃興如等[26]篩選出的3株 PAHs降解菌SL-1、02173和 02830，經(jīng)16sRNA基因序列分析，02173和02830分別與假單胞菌屬中的Pseudomonasalcaliphila和Pseudomonas corrugate同源性最近，SL-1為新類群Rhizobiumpetrolearium的模式菌株，其降解實驗表明，菌株SL-1 3 d內(nèi)對單一 PAHs，即菲（100 mg·L-1）和芘（50 mg·L-1）的降解率分別達100%和48%，5 d后能降解74%的芘；而其3 d內(nèi)對混合PAHs中菲和芘的降解率分別為75.89%和81.98%。菌株02173和02830 3 d內(nèi)對混合PAHs 中萘（200 mg·L-1）、芴（50 mg·L-1）、菲（100 mg·L-1）和芘（50 mg·L-1）的降解率均分別超過97%。但能夠利用B[a]P作為唯一碳源和能源并對其有降解作用的菌株很少見。已經(jīng)報道過的有霉菌可可毛色二孢菌[24]、綠色木霉[16]、細菌-真菌[27]、氮單胞菌[19]，以及銅綠假單胞菌（報道較多）等。盡管芽孢桿菌屬的很多細菌具有強降解PAHs能力，如張宏波等[28]從PAHs污染的土壤中分離到一株以芘作為碳源生長的高效降解菌，屬于短短芽孢桿菌屬（Brevibacillus parabrevis），能耐受含芘1000 mg·L-1的無機鹽液體培養(yǎng)基，在含芘200 mg·L-1的無機鹽液體培養(yǎng)基中7 d的降解效率達到51.02%，而且對培養(yǎng)基具有較廣泛的pH適應(yīng)范圍，在去除環(huán)境污染方面發(fā)揮著重要作用[29]，但芽孢桿菌屬對B[a]P有較強的降解能力的菌株還鮮有報道。

圖2 菌株BB-1的生長曲線和對B[a]P的降解Figure 2 Growth and benzo[a]pyrene degradation curvesof strain BB-1

2.2 菌株BB-1對B[a]P的降解特性

2.2.1 菌株BB-1的降解曲線

根據(jù)1.2.3所述測定方法，采用處于對數(shù)期（48 h）的菌懸液，在培養(yǎng)基pH值為7.0的條件下考察菌株BB-1對B[a]P的降解能力。由圖2可以看出，培養(yǎng)初期，菌株BB-1對B[a]P的降解能力較弱，隨著培養(yǎng)時間的延長，其降解B[a]P的能力逐漸增強。菌株BB-1在培養(yǎng)24 h后就開始降解B[a]P。培養(yǎng)4 d時，降解率已經(jīng)顯著提高，達到40.74%。6 d后，降解率繼續(xù)逐漸升高，液體培養(yǎng)基中B[a]P的殘留率僅有45.78%±2.44%，菌株BB-1對B[a]P的降解率為54.22%。到第8 d，B[a]P的殘留率降低最明顯，達到33.64%±1.18%（降解率為66.36%）。之后2 d降解率變化不明顯，而未投加菌株的培養(yǎng)基在8 d后測得的B[a]P降解率為3.69%±0.63%，和投加菌株的降解率對比差異明顯。10 d后，投加菌株BB-1的液體培養(yǎng)基中B[a]P的殘留率僅為32.96%±1.63%。光密度OD600結(jié)果顯示：培養(yǎng)1 d后OD600值僅為0.007 3±0.002 2；培養(yǎng)第3 d開始細菌數(shù)量顯著增加，說明其生長曲線存在一定的延滯期；第6 d OD600值為0.683 9±0.008 3；到第8 d達到最高值0.967 6±0.007 4。這些結(jié)果都說明菌株BB-1可以利用B[a]P作為主要碳源進行生長繁殖并對其有很高的降解能力。

從B[a]P殘留率和降解時間的曲線趨勢可以看出，菌體對B[a]P的降解經(jīng)過了很短的延滯期到快速降解期，最后進入平緩期。說明菌體在反應(yīng)初期對外源物質(zhì)有一個適應(yīng)過程，一方面B[a]P自身毒性抑制了菌體生長，但另一方面，菌體在B[a]P的誘導(dǎo)下開始產(chǎn)生降解酶，所以此時降解率較低。2 d后，菌體已經(jīng)適應(yīng)了外來碳源，菌體繁殖速度加快，在大量降解酶作用下對B[a]P利用率增加，使得體系里B[a]P的殘留率迅速下降，如圖中2~8 d的曲線所示。而8~10 d，曲線趨于平緩，變化不明顯，且OD600急速下降，說明菌體的生長受到抑制，可能是由于隨著降解的進行，產(chǎn)生了很多有機酸[30-31]，改變了體系pH，影響了菌體的代謝；或者是小分子的產(chǎn)物與B[a]P形成了碳源之間的競爭，降低了B[a]P的降解率；也可能是因為產(chǎn)生了一些毒性中間產(chǎn)物在菌體內(nèi)累積，菌體為了降解中間產(chǎn)物又要進入一輪新的適應(yīng)期。

菌株BB-1是通過為期30 d的B[a]P富集培養(yǎng)后篩選得到的，并且在接入含B[a]P液體培養(yǎng)基前又再次進行了細菌馴化。從圖2中B[a]P殘留率曲線可以發(fā)現(xiàn)菌株BB-1對B[a]P的降解延滯期非常短，這表明引進菌種的馴化對于降解微生物的實際應(yīng)用是十分必要的。

另外，根據(jù)劉海濱等[24]的研究，可可毛色二孢菌經(jīng)過 10 d 降解，B[a]P（初始濃度為 100 mg·L-1）的降解率為52.5%±1.5%?？梢?，多數(shù)研究都集中在高濃度的降解上，對于比較接近真實情況的中低濃度且高降解率細菌的研究很少，本研究篩出的BB-1具有很強的實踐性。

2.2.2 菌株BB-1降解B[a]P最佳pH

微生物對有機污染物的生物降解受環(huán)境中多種因素的制約，為了確定菌株BB-1降解B[a]P的最佳pH值，測定了不同初始pH值下8 d后的B[a]P降解率。由表1可以看出，菌株BB-1對酸堿性有很強的適應(yīng)能力，在pH 4~10范圍內(nèi)都可以利用B[a]P作為唯一碳源生長，且均可不同程度地降解B[a]P，只是不同pH值條件對B[a]P降解能力的影響存在顯著差異。由表1可知，在中性條件下，該菌株8 d后對B[a]P的降解率最高，達66.36%，OD600值為0.967 6±0.007 4；在弱堿（pH值為8）條件下，8 d后其對B[a]P的降解效果也比較好，降解率為55.21%，OD600值為0.812 1±0.010 3；但在強堿（pH值為10）和酸性（pH值為6和4）條件下，菌株BB-1對B[a]P的降解率普遍偏低，均未超過40%，OD600值很低。說明在中性和弱堿體系中BB-1的降解效果優(yōu)于酸性和強堿體系。這可能是因為B[a]P在降解過程中會生成小分子的有機酸類，與堿性體系中和或趨向弱酸性，這都利于微生物的生長繁殖和代謝降解[32-33]。而在強酸強堿條件下，菌株BB-1的生長活性和降解能力都受到抑制作用，而細胞表面也可能受到破壞，或者出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，進而影響其對B[a]P的降解。綜上，菌株BB-1的最佳降解pH值為7~8。蔡瀚等[33]的研究也發(fā)現(xiàn)：在pH=7時，B[a]P降解率達到最高，為46.32%。

表1 不同pH值對菌株BB-1降解B[a]P的影響（±S.D）Table1 The influence of different pH on B[a]Pdegradation by strain BB-1

圖3 不同含量蔗糖對菌株BB-1降解B[a]P的影響Figure 3 The effect of variousadded sucroseconcentrationson B[a]Pdegradation by strain BB-1

2.2.3 不同含量蔗糖對菌株BB-1降解B[a]P的影響

為了考察外加無毒害碳源對BB-1降解B[a]P的影響情況，選擇加入不同濃度的蔗糖，測定相應(yīng)的B[a]P降解率。當培養(yǎng)基中添加易被細菌利用的蔗糖并同樣經(jīng)過8 d培養(yǎng)時，對比未添加蔗糖的培養(yǎng)基，降解效能有明顯改變，見圖3。在0.1%蔗糖與5 mg·L-1B[a]P共存條件下，促進了菌株BB-1對B[a]P的降解，降解率為70.56%±2.02%；當蔗糖濃度增加至0.5%時，進一步促進了該菌株的降解效能，降解率增加至74.89%±1.34%，而OD600也由0.996 3±0.079 6增加至 1.271 3±0.027 3。

目前普遍認為，PAHs系一類難降解污染物，尤其是高分子量且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的B[a]P更難被微生物降解[26，34]。共代謝是被廣泛認可的提高微生物降解PAHs的有效方式[20]。它是通過改變微生物碳源與能源的底物結(jié)構(gòu)，增大微生物對碳源與能源的選擇范圍，從而達到微生物利用并降解PAHs的目的[35]。常見的共代謝底物多為和PAHs本身結(jié)構(gòu)相似的有機物或其中間代謝產(chǎn)物[23]，但這些物質(zhì)除來源有限，還存在競爭性抑制和一定的毒害性等弊端[15，36]。有研究表明，選擇較易被利用的碳源如蔗糖、葡萄糖等作為有機污染物的共代謝底物能夠明顯提高微生物對PAHs的降解率，并具有來源廣泛、無毒害，和PAHs無競爭性抑制作用等優(yōu)點[18-19，36]。本研究也表明，蔗糖能夠促進菌株BB-1對B[a]P的降解，但這種促進作用與糖的濃度有關(guān)。因此，選擇合適的共代謝底物并調(diào)整至適宜的濃度是應(yīng)用共代謝作用降解B[a]P的關(guān)鍵問題之一。

此外，如果將BB-1菌株直接投入到受B[a]P污染的土壤中，其降解特性不一定十分理想，還需要對菌株進行馴化，使降解基因恢復(fù)活性，并通過環(huán)境條件控制和外源底物添加促使降解菌能夠在一定程度上抵御土著微生物的競爭抑制作用。

3 結(jié)論

（1）通過富集培養(yǎng)，獲得了一株能以B[a]P為唯一碳源的新的高效降解菌株BB-1，它在B[a]P濃度為5 mg·L-1的條件下，30℃振蕩培養(yǎng)8 d，對B[a]P的降解率提高最快，達到66.36%±1.18%；

（2）運用16sRNA基因擴增、Blast軟件分析等鑒定方法，初步鑒定降解菌株BB-1為巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）；

（3）強酸、強堿條件對菌株BB-1的生長具有抑制作用，培養(yǎng)基初始pH值為7時，B[a]P的降解率最大；

（4）共代謝底物蔗糖可促進菌株BB-1對B[a]P的降解，當0.5%蔗糖與5 mg·L-1B[a]P共存時，明顯促進了菌株BB-1的降解效能，第8 d降解率已經(jīng)達到74.89%±1.34%。

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