楊 波，陳銀萍，柯昀琪，閆志強，余沛東，師小平

（蘭州交通大學環(huán)境與市政工程學院，蘭州 730070）

隨著人類文明的進步，工業(yè)化不斷加強，在促進經(jīng)濟發(fā)展和提高人民生活水平的同時，越來越多的環(huán)境問題相繼出現(xiàn)，尤其是由采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬超標制品等人為因素所致的重金屬污染日益加劇，引起了世界各國科學家的高度重視，重金屬環(huán)境污染防治已迫在眉睫。Cd污染是常見的重金屬污染之一，據(jù)全國土壤污染狀況調(diào)查，Cd含量分布呈現(xiàn)從西北到東南、從東北到西南方向逐漸升高的態(tài)勢，Cd污染物點位超標率為7.0%，總體情況不容樂觀[1]。

重金屬污染土壤的傳統(tǒng)修復方法，如開挖、洗滌和土地填埋等，由于對環(huán)境破壞大且成本高昂，限制了其可行性[2]。而植物修復技術(shù)是一種生物友好型的技術(shù)，越來越受到人們的關(guān)注[3-4]。但是它也有重大缺陷，就是對重金屬提取率不高。近年來，有大量關(guān)于施用螯合劑以增強植物對重金屬的吸收和富集的研究報道，其中生物友好型的螯合劑乙二胺二琥珀酸（EDDS）備受關(guān)注。Luo等[5]研究表明，EDDS可以增強多種植物物種對重金屬Cd、Cu、Pb、Zn和Ni的攝取量。白薇楊等[6]發(fā)現(xiàn)，螯合劑的存在明顯增加了植物對重金屬Pb、Cu和Cd的富集系數(shù)，且EDDS對環(huán)境的風險比較小。Attinti等[7]研究了EDDS對香根草萃取Pb效率的影響，土壤和滲濾液結(jié)果表明，EDDS的應用增加了土壤中Pb的溶解度。

三葉鬼針草（Bidens pilosa L.）是一年生草本植物，生物量大，根系發(fā)達，抗逆性強，具有較強的爭光、爭水和爭肥能力，對重金屬污染耐性強，富集性和轉(zhuǎn)移性高[8]，是修復重金屬污染土壤較理想的種質(zhì)資源[9]，但關(guān)于EDDS強化三葉鬼針草吸收Cd的能力尚不明確。

本文通過盆栽實驗研究不同濃度EDDS對Cd污染條件下三葉鬼針草生長、抗氧化酶活性、Cd含量以及Cd富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響，以期為三葉鬼針草和EDDS應用于Cd污染土壤的修復提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三葉鬼針草種子購自泰山野菜種植基地。EDDS為麥卡希試劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，其結(jié)構(gòu)如下所示：

1.2 實驗設計

實驗土壤為采自甘肅省蘭州市榆中縣（103°49′15″~104°34′40″E，35°34′20″~36°26′30″N）周邊農(nóng)田耕地0~20 cm的表層土，室內(nèi)自然風干后過 2 mm篩備用。土壤基本理化性質(zhì)：pH值7.76，有機質(zhì)含量 19.80 g·kg-1，全氮含量 1.19 g·kg-1，Cd 含量 0.49 mg·kg-1。將2 kg表層土壤與一定量的污染物（以CdCl2·2.5H2O 模擬 Cd 脅迫，濃度為 40 mg·kg-1，以溶液加入到土壤中）充分混勻后裝入塑料盆（口徑20 cm、高度15 cm），平衡3周后，選取均勻、飽滿的三葉鬼針草種子，將其浸泡在1%NaClO溶液中10 min，用蒸餾水沖洗干凈，晾干后播種以提高種子的發(fā)芽率和抗病性。種子播種到塑料盆中，播種深度 0.5 cm，盆栽置于光照培養(yǎng)架上，在溫度15~25℃、色溫 6500 K 光照下，每日光照 14 h（6：00—20：00），黑暗10 h，不定期的更換位置，待發(fā)芽后間苗，每盆10株，植株在重金屬污染土壤中生長，以自來水澆灌（水中未檢測出Cd），使土壤含水量經(jīng)常保持在田間持水量（該土壤田間持水量在20%左右）的70%左右。為防止污染物淋溶滲漏損失，在盆下放置塑料托盤并將滲漏液倒回盆中。待三葉鬼針草生長60 d左右、長出6片真葉時，配制濃度為0（對照，CK）、0.5、1.5、2.5、5.0 mmol·L-1的 EDDS 溶液，將其pH調(diào)到7.0。分別取上述濃度的溶液100 mL施入土壤中，每個處理3個平行，7 d后取樣進行各指標測定。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標的測定

取不同處理的植株各5株，小心抖落根系土，然后依次用自來水和蒸餾水分別小心沖洗3次，操作時盡量不損傷根系，用濾紙吸干水分。分別稱量地上部（莖和葉混合）和地下部（根）鮮重，用直尺測量其根長及株高。再將鮮植株置于烘箱中105℃殺青20 min，之后75℃下烘干至恒重，稱其地上部及地下部干重[10]。

1.3.2 Cd含量的測定

將烘干后的植物地上部和地下部分別研磨，稱取0.5 g于消解管中，加入15 mL HNO3-HClO4（4∶1，V/V），用DigiBlock EHD20型高溫消解儀消解至澄清，定容至25 mL；將花盆中土壤風干，用四分法取部分樣品研磨過0.149 mm篩，稱取0.5 g，用HCl-HFHNO3-HClO4法消解至澄清，定容至25 mL。用美國Nicolet公司的220型火焰原子吸收分光光度計測定Cd 含量[11]。

1.3.3 酶活性測定

紫外分光光度法測定抗壞血酸氧化酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和過氧化氫酶（CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[12]。

以上所有指標的測定均重復3次。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

富集系數(shù)（Bioaccumulation Factor，BF）也稱吸收系數(shù)，是指植物重金屬濃度（地上部和地下部Cd濃度之和）與土壤中重金屬濃度（土壤Cd添加量即40 mg·kg-1）之比；轉(zhuǎn)運系數(shù)（Translocation Factor，TF）是指植物地上部重金屬濃度與地下部同種重金屬濃度的比值[13]。

采用Excel和SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，利用Origin 2016軟件繪圖。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草生長的影響

加入EDDS培養(yǎng)7 d之后，對比各處理對生長的影響（表 1）可知：40 mg·kg-1Cd脅迫下，0.5~1.5 mmol·L-1的EDDS有利于三葉鬼針草生長，但是施加2.5~5.0 mmol·L-1的EDDS不利于其生長。與CK相比，施加 0.5 mmol·L-1和 1.5 mmol·L-1EDDS 分別使株高增加19.03%和16.69%、根長增加13.10%和10.48%、地下部鮮重增加54.55%和45.45%、地上部鮮重增加54.49%和42.95%、地下部干重增加32.64%和7.53%、地上部干重增加23.99%和19.49%（P<0.05）；而施加 2.5 mmol·L-1和 5.0 mmol·L-1EDDS 均抑制了植物生長，使株高、根長、地下部和地上部鮮重、干重顯著降低（P<0.05）。

2.2 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草Cd含量及富集和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

表1 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草幼苗生長的影響（平均數(shù)±SE）Table 1 Effectsof EDDSon the growth of the Bidens pilosa seedlings under Cd stress（mean±SE）

隨著EDDS濃度的升高，地上部和地下部Cd含量、轉(zhuǎn)運系數(shù)以及富集系數(shù)均呈先增后減的趨勢，但土壤Cd含量呈先減后增的趨勢（表2）。由表2可看出，施加5.0 mmol·L-1EDDS時，土壤中Cd含量最高，與CK相比無顯著差異，且顯著高于其他處理，這是因為高濃度EDDS對植物生長有抑制作用，使其生長狀況不良，對Cd的吸收量減少，使土壤中Cd含量較高；而施加0.5~2.5 mmol·L-1EDDS時，由于植物對Cd的吸收作用，導致土壤中Cd含量低于CK。

與 CK 相比，施加低濃度（0.5~1.5 mmol·L-1）EDDS，均使植物地上部、地下部Cd含量顯著增加，其中施加1.5 mmol·L-1EDDS使地上部和地下部Cd含量達到最高，分別比CK顯著增加了146.72%和26.31%（P<0.05），其中地上部分 Cd 含量達到 109.454mg·kg-1，大于土壤重金屬污染修復植物應具備的莖或葉富集重金屬的臨界Cd含量（100 mg·kg-1）。而施加2.5 mmol·L-1和 5.0 mmol·L-1EDDS 均使地下部 Cd 含量顯著減少，施加5.0 mmol·L-1EDDS使地上部Cd含量顯著減少（P<0.05）。

表2 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草不同部位Cd含量、富集系數(shù)及轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響（平均數(shù)±SE）Table 2 Effectsof EDDSon Cd content in different parts，bioaccumulation factor，and translocation factor of the Bidens pilosa seedlings under Cd stress（ mean ± SE）

施加0.5~2.5 mmol·L-1EDDS使富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)均顯著高于CK（P<0.05），且大于1.0，說明Cd脅迫下較低濃度的EDDS可顯著增加三葉鬼針草對Cd的富集和轉(zhuǎn)運作用。而施加5.0 mmol·L-1EDDS，富集系數(shù)明顯低于CK，說明該濃度不利于三葉鬼針草對Cd的吸收，但轉(zhuǎn)運系數(shù)略高于CK。

2.3 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草抗氧化酶系統(tǒng)的影響

如圖1A所示，只有0.5 mmol·L-1EDDS使根中APX活性略高于CK，其余濃度EDDS均使根中APX活性顯著低于CK（P<0.05）；莖中APX活性在施加1.5 mmol·L-1EDDS后達到最大且顯著高于CK，而其余濃度均使APX活性顯著低于CK（P<0.05）；葉中APX 活性在施加較低濃度（0.5 mmol·L-1和 1.5 mmol·L-1）EDDS 后顯著增強，且在 1.5 mmol·L-1EDDS 時達到最大，較CK顯著增加了66.84%（P<0.05），但隨著EDDS施加濃度的進一步增加，在施加2.5 mmol·L-1EDDS后APX活性增加不顯著（P>0.05），在施加5.0 mmol·L-1EDDS 后則顯著降低（P<0.05）。

如圖1B所示，隨施加EDDS濃度的升高，根中CAT活性呈先升后降的趨勢，0.5~2.5 mmol·L-1EDDS均使根中CAT活性顯著高于CK（P<0.05），且在施加2.5 mmol·L-1EDDS時達到最大，較 CK增加了105.34%，而在施加5.0 mmol·L-1EDDS時顯著低于CK（P<0.05）；莖中 CAT活性呈一直上升的趨勢，且在施加5.0 mmol·L-1EDDS時達到最大；葉中CAT活性雖然呈先升后降的趨勢，但其活性均顯著高于CK（P<0.05）。

如圖1C所示，除0.5 mmol·L-1EDDS使根中GR活性低于CK外，其余濃度使根、莖和葉中GR均顯著高于CK（P<0.05）。隨施加EDDS濃度的升高，根中GR活性呈一直增強的趨勢，莖中在0.5 mmol·L-1EDDS時達到最大，之后呈一直下降的趨勢，但仍顯著高于CK，葉中隨施加EDDS濃度的升高呈先升后降的趨勢，在施加2.5 mmol·L-1EDDS時達到最大，在5.0 mmol·L-1EDDS時顯著下降，但仍顯著高于CK。

如圖1D所示，施加0.5 mmol·L-1EDDS使根、莖、葉中POD活性顯著增強，較CK分別增加了112.60%、174.31%、154.86%（P<0.05），但隨施加 EDDS濃度的升高，POD活性則持續(xù)下降。

如圖1E所示，施加0.5 mmol·L-1EDDS使根中SOD活性顯著增強，較CK增加了213.37%（P<0.05），隨施加EDDS濃度的升高，根中SOD活性呈一直下降的趨勢，與CK無顯著差異（P>0.05）；莖中SOD活性隨施加EDDS濃度的升高呈先升后降的趨勢，在施加2.5 mmol·L-1EDDS時達到最大，較CK顯著增加了29.59%（P<0.05）；施加 0.5、2.5、5.0 mmol·L-1EDDS均使葉中SOD活性顯著高于CK（P<0.05），盡管施加1.5 mmol·L-1EEDS時與CK差異不顯著，但SOD活性仍有提高。

2.4 三葉鬼針草幼苗根中Cd含量與抗氧化酶系統(tǒng)的相關(guān)性及回歸分析

根是植物吸收重金屬的主要部位，進而才向地上部分轉(zhuǎn)移，為探討三葉鬼針草幼苗中抗氧化酶系統(tǒng)是否對其吸收和積累Cd的能力有影響，本研究對三葉鬼針草幼苗根中Cd含量與抗氧化酶系統(tǒng)做了相關(guān)性及回歸分析，結(jié)果表明（表3）：根中Cd含量與GR和APX負相關(guān)，與CAT、POD、SOD呈正相關(guān)，但其相關(guān)性并不顯著，說明抗氧化酶系統(tǒng)與三葉鬼針草幼苗吸收和積累Cd的能力沒有直接的相關(guān)性，但Cd脅迫下，隨著EDDS濃度的變化抗氧化酶系統(tǒng)被啟動，對脅迫過程中積累的活性氧進行清除，減輕了外界脅迫對植物造成的膜損害。

圖1 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草幼苗APX、CAT、GR、POD和SOD活性的影響Figure 1 Effects of EDDSon activities of APX，CAT，GR，POD，and SODin the Bidens pilosa seedlings under Cd stress

回歸分析結(jié)果如下：

Y=25.033-18.897X1R2=0.052

Y=14.758+0.060X2R2=0.308

Y=37.492-36.265X3R2=0.254

Y=8.241+0.157X4R2=0.250

Y=9.180+0.983X5R2=0.314

式 中 Y 為 Cd 含 量 ，X1、X2、X3、X4、X5分 別 為APX、CAT、GR、POD、SOD 活性，R 為相關(guān)系數(shù)。回歸分析與相關(guān)性分析結(jié)果相同。

3 討論

3.1 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草生長及Cd富集能力的影響

螯合劑對金屬離子具有較強的螯合能力，進入土壤后，可活化土壤中重金屬，減少土壤對重金屬的吸附，提高植物對重金屬的可利用性，進而被植物最大限度地吸收[14]。目前，螯合劑輔助植物修復重金屬污染土壤已成為研究熱點之一。但是，施用螯合劑也有一定的風險，如對植物產(chǎn)生毒性（影響其生長、葉片變黃等）[15-16]，破壞土壤結(jié)構(gòu)，使其養(yǎng)分流失，對土壤生態(tài)環(huán)境造成影響等。本研究結(jié)果表明：Cd脅迫下，施加較低濃度的EDDS有利于三葉鬼針草幼苗的生長，使株高、根長、地上部鮮干重和地下部鮮干重顯著增加，而施加高濃度EDDS則不利于植物的生長，由表1可看出株高、根長、地下部和地上部鮮重、干重顯著降低。該結(jié)果與袁菊紅[13]和Hseu等[17]研究結(jié)果一致，但劉金等[18]發(fā)現(xiàn)EDDS會不同程度減少苧麻生物量，熊國煥等[19]的結(jié)果表明EDDS對大葉井口邊草生物量無明顯的影響。這種結(jié)果的差異可能與植物物種，試驗方法，螯合劑種類、濃度、施加方式、施加時間，土壤類型等不同有關(guān)，而且這種差異究竟是何種原因?qū)е逻€需進一步研究。

表3 三葉鬼針草幼苗根中抗氧化酶系統(tǒng)和Cd積累的相關(guān)性分析Table 3 Correlations between antioxidant enzyme systemand Cd accumulation in Bidens pilosa root

適宜濃度的EDDS可增加土壤中重金屬活性而被植物更有效地吸收，促進植物地上部對重金屬更多的吸收和累積。在土壤重金屬污染植物修復研究中，富集系數(shù)越大，表明植物對重金屬的吸收累積能力就越強；轉(zhuǎn)移系數(shù)越大，則表明重金屬從根系向地上部器官轉(zhuǎn)運能力就越強[20]，越有利于植物修復重金屬污染土壤。研究表明EDDS可促進苧麻對Cd的吸收[21]，增加向日葵對鈾的吸收和轉(zhuǎn)運能力[22]，促進金盞菊根、莖、葉各器官對Cd的富集[23]，增加菊花和黑麥草對Cu的積累[24]。本研究結(jié)果表明：Cd脅迫下，施加低濃度EDDS顯著增加了三葉鬼針草地上部和地下部Cd含量，其中施加1.5 mmol·L-1時，Cd積累量大于土壤重金屬Cd污染修復植物應具備的莖或葉富集重金屬的臨界含量，說明低濃度EDDS可顯著增強植物對Cd的吸收和積累，而且三葉鬼針草的富集系數(shù)與轉(zhuǎn)移均在1.0之上，表明其具有超富集植物的特征[25]；而高濃度則受到抑制，這可能是由于高濃度EDDS對三葉鬼針草有一定毒害作用，不利于植物生長。除施加5.0 mmol·L-1EDDS富集系數(shù)低于CK以外，添加EDDS使富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)均高于CK，表明EDDS可以促進Cd在植物中富集以及向地上部轉(zhuǎn)移，在植物修復方面是有利的。

3.2 EDDS對Cd脅迫下三葉鬼針草抗氧化酶系統(tǒng)的影響

在沒有受到外界脅迫的情況下，植物體內(nèi)活性氧（ROS）代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)。在Cd和EDDS的脅迫下植物體內(nèi)平衡被打破，對植物生長和生理特性產(chǎn)生影響，進而影響植物的生長發(fā)育。因此，植物將對這種變化做出反應，比如激活抗氧化酶系統(tǒng)，使之酶活性提高以維持活性氧平衡[26-28]。研究表明砷處理使大葉井口邊草葉[29]、黑麥草和叢枝菌根單一或聯(lián)合修復使黑麥草[30]、酸雨使毛竹[31]、低濃度Cd脅迫使三葉鬼針草幼苗[32]中抗氧化酶被誘導，活性增強，最大限度清除自由基，防止其對植物的損傷。本研究結(jié)果表明：Cd脅迫下，施加不同濃度的EDDS，三葉鬼針草根、莖和葉中APX、CAT、GR、POD和SOD活性變化不盡相同。在施加低濃度EDDS時，根中CAT和GR優(yōu)先啟動，莖中APX、CAT和SOD優(yōu)先啟動，葉中APX、CAT和GR優(yōu)先啟動，清除植物體內(nèi)多余的ROS，保護植物細胞膜。在施加高濃度EDDS時，根中APX、POD和SOD起主要作用，莖中GR和POD，葉中SOD和POD起主要作用，從而減輕了外界脅迫對植物造成的膜傷害。酶活性在植物體內(nèi)反復變化一方面說明對Cd脅迫和EDDS較為敏感，另一方面也表明植物隨著Cd脅迫的持續(xù)以及EDDS濃度和環(huán)境的變化在不斷調(diào)整自身，從而適應多變環(huán)境，減輕逆境對植物自身的傷害，促進植物生長，并增加對重金屬的富集和轉(zhuǎn)運[11]。酶作用的不同可能是由于植物物種的種類、器官、實驗條件等差異造成的，具體是何原因主導需進一步實驗探索。

本研究中，盡管抗氧化酶系統(tǒng)與三葉鬼針草幼苗吸收和積累Cd的能力沒有直接的相關(guān)性，但在Cd脅迫下，施加低濃度 EDDS（0.5~2.5 mmol·L-1）三葉鬼針草根中CAT、GR、SOD和POD活性能夠維持或增加，其中CAT活性增加尤為顯著，表明其具有強大的清除自由基的能力，減輕了脅迫對植物膜系統(tǒng)造成的損害，維持植物正常生長狀況，有利于Cd的富集。而施加5.0 mmol·L-1EDDS 5種酶均顯著低于CK，說明Cd脅迫和高濃度的EDDS對植物造成的影響已超過了植物抗氧化能力限度，引起細胞代謝失調(diào)，抑制了酶的合成，不能有效清除活性氧，細胞膜系統(tǒng)受損，植物生長受到抑制，對Cd的吸收減少。表明EDDS施入Cd污染土壤后，通過影響三葉鬼針草生理生化過程以響應重金屬Cd的脅迫[33]。

4 結(jié)論

（1）Cd脅迫下，施加低濃度EDDS會顯著促進三葉鬼針草幼苗的生長，增加其對Cd的吸收、富集和轉(zhuǎn)運。

（2）Cd脅迫下，隨著不同濃度EDDS的施加，三葉鬼針草幼苗地上部和地下部組織中不同抗氧化酶優(yōu)先啟動，清除Cd脅迫誘導產(chǎn)生的過量ROS，抵御膜脂過氧化，減輕逆境對膜系統(tǒng)造成的損傷。

（3）施加EDDS可增強三葉鬼針草對Cd污染土壤的修復效果，結(jié)合生長指標，充分考慮土壤重金屬類型和螯合劑可能對環(huán)境造成的二次污染，優(yōu)先選擇施用量為 1.5 mmol·L-1。

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