范麗萍 孫凱 張永為 周康 王劍超★

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因不明的直腸或結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病，是胃腸道最嚴重的疾病之一，其發(fā)病原因及機制尚不明確。IL-17細胞因子是新發(fā)現(xiàn)的一類參與急性和慢性炎癥反應(yīng)的細胞因子，其在UC的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［1-2］。AHR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）超家族中的bHLH-PAS亞家族成員。研究發(fā)現(xiàn)AHR可以調(diào)控Th17細胞和Treg細胞的分化［3］。在動物模型中，AHR的活化能抑制促炎因子的產(chǎn)生，推測AHR可以調(diào)控IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本資料旨在分析AHR對促炎癥相關(guān)因子CCL20﹑CXCL2和IL-6產(chǎn)生的影響，以明確AHR介導(dǎo)的炎癥效應(yīng)在UC發(fā)生發(fā)展中的作用，為AHR作為臨床防治UC的一個潛在靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 Hela細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所，在本實驗室用DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。DMEM高糖培養(yǎng)基：購自美國Thermo公司，4℃保存。使用時用10%新生牛血清配制成DMEM高糖完全培養(yǎng)液。胎牛血清：購自杭州四季青生物工程材料研究所，56℃滅活30min，-20℃保存。二甲基亞砜（DMSO）：分析純，購自美國SIGMA公司。細胞RNA抽提試劑RNAiso plus：購自日本TAKARA公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒﹑rTaq DNA聚合酶﹑實時定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM II（DRR081A）：購自日本TAKARA公司。AHR抗體：購自Proteintech公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000：購自美國Invitrogen公司。CXCL2和IL-6 Elisa試劑盒：購自美國eBioscience公司。結(jié)腸組織：UC結(jié)腸組織和正常的結(jié)腸組織來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院。正常對照結(jié)腸組織來自結(jié)腸癌患者病理保留的癌旁正常組織。10例UC組織中男5例，女5例；10例正常結(jié)腸組織中男6例，女4例。兩組患者年齡均為30～50歲。

1.2 實驗方法 （1）細胞培養(yǎng)﹑復(fù)蘇和凍存：Hela細胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)在5%CO2﹑37℃及飽和濕度條件下生長及傳代，實驗時取對數(shù)生長期細胞。凍存細胞時應(yīng)選用對數(shù)生長期的細胞，一般一小瓶含8ml培養(yǎng)基的細胞可以凍存2管。離心棄上清液后，加入凍存液（50%新生牛血清+10%DMEM培養(yǎng)基+10%DMSO），分裝至無菌凍存管中，密閉凍存管，置于-80℃冰箱過夜，次日再放入液氮罐。（2）細胞總RNA的制備：根據(jù)TAKARA RNAiso plus試劑說明進行操作，提取RNA。貼壁細胞直接用PBS洗1次，懸浮細胞離心收集后用PBS洗1次，按照1×107細胞加1ml RNA抽提試劑Trizol，充分混勻后；加入0.2ml氯仿（三氯甲烷）混勻，劇烈震蕩使其充分混勻，常溫靜置10min，4℃，12000 g離心15min；離心時在新EP管上編號，吸取上層水相層于新EP管中，再加入0.5 ml異丙醇顛倒混勻，室溫靜置 10min后，4℃，12000 g離心15 min；棄上清液，沉淀以預(yù)冷的75%乙醇（預(yù)先用DEPC水配制）洗滌，4℃，12000g離心 5 min后，棄上清液，再稍微離心，使殘余液體集于管底，用小槍頭吸凈管底的液體，空氣干燥；溶解于合適量DEPC水，進行濃度和純度測定后置于-80℃保存。（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。（4）結(jié)腸組織AHR免疫組化分析：用甲醛固定24h，石蠟包埋結(jié)腸組織，切片和染色按常規(guī)步驟處理。程序如下：首先在玻片上標記好腸炎組和正常組，用切片機完成切片，放入烤箱干燥后，用丙酮在室溫固定10min，使其在空氣中完全干燥脫水，緩沖液洗3min/2次，然后用過氧化物酶阻斷劑室溫反應(yīng)5min，以降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性染色，緩沖液洗5min/2次，然后用一抗稀釋液稀釋抗AHR抗體（1：50），37℃孵育2h。緩沖液充分洗滌后滴上增強子，室溫孵育20min，緩沖液洗5min/2次，加HRP酶標二抗，室溫下孵育30min，洗滌后與底物室溫作用30min，充分沖洗后鏡下觀察，結(jié)果根據(jù)染色情況進行盲評：-（陰性）；+（較弱陽性）；（中等強度染色）；+++（強陽性）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。所有的實驗結(jié)果均由三次或者三次以上獨立重復(fù)的實驗得出，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AHR在UC組織和正常結(jié)腸組織中的表達情況 見表1﹑圖1。

表1 AHR在正常結(jié)腸組織和UC組織中表達的結(jié)果［n（%）］

圖1 免疫組化顯示UC腸上皮細胞中低表達AHR

2.2 活化AHR對IL-17觸發(fā)的炎性細胞因子的變化 在Hela細胞中用AHR的激活劑10nM FICZ激動劑活化AHR，用DMSO作對照。AHR活化1h后用IL-17（50ng/ml）刺激0h﹑1h﹑3h﹑12h后收集RNA，用RT-PCR的方法檢測趨化因子CXCL2﹑CCL20和細胞因子IL-6在mRNA水平的表達變化。發(fā)現(xiàn)用FICZ活化后可以抑制IL-17誘導(dǎo)的CXCL2﹑CCL20和IL-6的mRNA水平，見圖2。

圖2 在Hela細胞中活化AHR抑制了IL-17誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生。觀察組和對照組之間采用非配對的t檢驗，★P＜0．05

2.3 過表達AHR表達對IL-17觸發(fā)的炎性細胞因子的變化 在Hela細胞中成功轉(zhuǎn)染Flag-AHR表達質(zhì)粒和空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染36h后用 IL-17（50ng/ml）刺激0h﹑1h﹑3h后收集RNA，用RT-PCR的方法檢測趨化因子 CXCL2﹑CCL20和細胞因子IL-6在mRNA水平的表達變化。發(fā)現(xiàn)過表達AHR可以抑制IL-17誘導(dǎo)的CXCL2﹑CCL20和IL-6的產(chǎn)生（如圖3）。

圖3 在Hela細胞中穩(wěn)定過表達AHR抑制了 IL-17誘導(dǎo)產(chǎn)生的趨化因子CXCL2、CCL20和細胞因子IL-6（★P＜0．05，★★P＜0．01）

2.4 干擾AHR表達對IL-17觸發(fā)的炎性細胞因子的變化 采用能夠干擾AHR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞，在Hela細胞中成功轉(zhuǎn)染AHR干擾質(zhì)粒和空白對照，轉(zhuǎn)染 36h后用 IL-17（50ng/ml）刺激0h﹑1h﹑3h后收集RNA，用RT-PCR的方法檢測細胞因子 CXCL2﹑CCL20和IL-6在mRNA水平的表達變化（如圖4）。發(fā)現(xiàn)用質(zhì)粒干擾AHR可以促進IL-17誘導(dǎo)的CXCL2﹑CCL20和IL-6 在mRNA的水平的表達。

圖4 在Hela細胞中干擾AHR表達促進IL-17誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生（★P＜0．05，★★P＜0．01，★★★P＜0．001）

3 討論

IL-17，主要來源于Th17細胞，在細菌和真菌感染的防御反應(yīng)中起著重要的作用，但也能誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生，越來越多的研究已證實，IL-17與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。有動物實驗顯示在小鼠DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，IL-17敲除的小鼠發(fā)病率和致死率比野生型低，顯示了IL-17在腸炎中的病理作用［5］。而IL-17信號通路充分活化的分子及其機制還有待于深入研究。本研究表明AHR參與并抑制了IL-17信號通路，抑制CXCL2﹑CCL20和IL-6的表達，是IL-17信號通路抑制的分子之一。

AHR最初發(fā)現(xiàn)是作為二惡英毒性的介導(dǎo)者，包括免疫毒性。持續(xù)激發(fā)AHR能導(dǎo)致人和動物其他的病理效應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)，AHR在小分子化合物的代謝和免疫中有雙重作用，但關(guān)于AHR參與機體自身免疫性疾病的具體機制，還有待進一步研究。AHR是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，AHR的活化不僅與細胞的增殖﹑分化﹑分泌有關(guān)，還與腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展有關(guān)。現(xiàn)有大量文獻研究AHR在免疫系統(tǒng)上的各種不同效應(yīng)，尤其在Th17細胞的調(diào)控上［6］。為了探討AHR是否參與了IL-17通路的調(diào)控，作者選取Hela細胞用FICZ進行AHR活化，然后再用IL-17刺激，觀察細胞因子產(chǎn)生的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)活化AHR以后抑制了趨化因子CXCL2﹑CCL20和細胞因子 IL-6等炎癥細胞因子的mRNA水平，證明AHR參與了IL-17通路傳遞，抑制了炎癥細胞因子的表達。采用過表達AHR的Hela細胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Hela細胞進行IL-17刺激實驗，顯示過表達AHR抑制了CXCL2﹑CCL20﹑IL-6的表達，另外，選取Hela細胞進行AHR干擾，再用IL-17刺激，觀察細胞因子產(chǎn)生的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾AHR表達以后顯著增加了CXCL2﹑CCL20﹑IL-6等炎癥細胞因子的mRNA水平，證明AHR參與了IL-17通路傳遞，抑制了促炎性細胞因子的表達。說明在Hela細胞中過表達AHR能起到負相調(diào)控IL-17信號傳導(dǎo)的作用。

本研究的體外實驗證實AHR能負向調(diào)控IL-17信號效應(yīng)，而IL-17在UC的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，本資料免疫組化結(jié)果顯示：10例正常的結(jié)腸組織腸上皮細胞全部表達強陽性，而10例UC4例表達強陽性，5例表達中陽性，1例表達弱陽性。說明AHR可能參與了UC的發(fā)病過程。另外發(fā)現(xiàn)，AHR表達增加，促炎癥因子表達受抑制。有文獻報道，在腸上皮內(nèi)，若AHR的活性低，腸道則會處于免疫激活狀態(tài)，易產(chǎn)生自身免疫性疾?。?］。在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，AHR的缺失或失活能增加腸炎的免疫病理作用，引起結(jié)腸上皮的損傷。AHR在腸上皮細胞間介導(dǎo)的信號通路也有待進一步研究。

［1］ Fujino S, Andoh A, Bamba S, et al． Increased expression of interleukin17 in inflammatory bowel disease． Gut, 2003,52(1):65-70．

［2］ Song X, Qian Y． The activation and regulation of IL-17 receptor mediated signaling．Cytokine, 2013,62(2):175-182．

［3］ Veldhoen M, Hirota K, Westendorf AM, et al． The aryl hydrocarbon receptor links TH17-cell-mediated autoimmunity to environmental toxins． Nature, 2008,453(7191):106-109．

［4］ Zhu S,Qian Y．IL-17/IL-17 receptor system in autoimmune disease: mechanisms and therapeutic potential． Clincal Sci,2012,122(11):487-511．

［5］ Ito R,Kita M,Shin-YaM,et al．Involvement of IL-17A in the pathogenesis of DSS-induced colitis in mice．Biochem Biophys Res Commun, 2008,377(1):12-16．

［6］ Kimura A,Naka T,Nohara K,et al．Aryl hydrocarbon receptor regulates Stat1 activation and participates in the development of Th17 cells． Proc Natl Acad Sci,USA,2008,105(28):9721-9726．

［7］ Li Y,Innocentin S,Withers DR,et al．Exogenous stimuli maintain intraepithelial lymphocytes via aryl hydrocarbon receptor activation．Cell,2011,147(3)629-640．