熊倩 劉秋虹 吳清萍 石玉梅

乳腺癌已成為女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位，惡性程度高，侵襲性明顯，復發(fā)﹑轉(zhuǎn)移幾率大。他莫昔芬（TAM）是目前雌激素受體（ER）表達陽性的乳腺癌的一線藥物，其在乳腺組織中能競爭性與雌激素受體結(jié)合，從而阻礙ER表達陽性的乳腺腫瘤的生長和繁殖。腫瘤的增殖及新生血管能力在腫瘤的生長﹑轉(zhuǎn)移﹑過程中發(fā)揮著重大的作用，目前用阻斷腫瘤血管來治療腫瘤的方法正逐步探討及應用。本實驗通過乳腺癌MCF-7細胞裸鼠成瘤，TAM治療后腫瘤檢測直徑大小及增殖標記（CyclinD1﹑Ki67）﹑血管標記（VEGF﹑CD34）的變化，探討TAM對乳腺癌的抗細胞增殖及血管形成的作用，期望為實驗室及臨床提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 建立MCF-7乳腺癌細胞荷瘤裸鼠模型。乳腺癌MCF-7細胞由蘇州大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學實驗室留存；雌性BALB/c裸鼠，4～5周齡，20只，上海斯萊克實驗動物有限公司。人乳腺癌MCF-7細胞株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，無菌條件下接種于裸鼠右側(cè)腋窩偏前脂肪墊下，繼續(xù)飼養(yǎng)于無菌層流罩中。種瘤6～9d后裸鼠右側(cè)胸壁皮下可觸及瘤結(jié)節(jié)，20只均建模成功。自裸鼠接種MCF-7細胞次日起，于右側(cè)胸壁瘤旁皮下注0.15mg/ml雌激素0.2ml/（只·d），直至取瘤。

1.2 實驗分組及干預 將建模成功荷瘤裸鼠（細胞接種后第10天）隨機分為觀察組及對照組，每組各10只。觀察組給予 TAM 5mg/（kg·d） 灌胃 1 次，對照組給藥蒸餾水2ml灌胃。

1.3 腫瘤病理學檢測 用藥21d后脫頸處死裸鼠取瘤，記錄腫瘤大小﹑質(zhì)地情況，腫瘤平均直徑=（最大直徑+最小直徑）/2。腫瘤10%福爾馬林固定24h，常規(guī)脫水包埋HE染色。

1.4 免疫組化SP法檢測 結(jié)果由三位高年資病理科醫(yī)師閱片，并對免疫結(jié)果做定量分析。CyclinD1﹑Ki67陽性表達在細胞核，隨機選取 10個高倍視野，每個視野計數(shù) 100個腫瘤細胞，計數(shù)陽性細胞百分比例。VEGF陽性表達在胞漿/胞膜，采用半定量分析法0%～5%為0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分；染色強度：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；兩個值相乘為最終判讀結(jié)果。CD34標記微血管密度（MVD）先在低倍鏡下找血管豐富區(qū)域，然后在高倍鏡下計數(shù)5個不同區(qū)域的血管數(shù)，然后求其平均值作為MVD值。以鏡下胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒標記為血管內(nèi)皮細胞陽性。腫瘤內(nèi)壞死區(qū)及與腫瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管不計數(shù)，有厚平滑肌壁的血管也排除在外。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤大體檢測及直徑測量 腫瘤多為橢圓，巨檢與周圍組織分界尚清，切面灰白，質(zhì)地稍硬，測量直徑=（最大直徑+最小直徑）/2。觀察組腫瘤平均直徑（0.9600±0.12649）cm，對照組腫瘤平均直徑（1.0800±0.15492）cm，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。腫瘤直徑曲線圖見圖1。

圖1 腫瘤直徑（cm）曲線圖

2.2 免疫組化結(jié)果 見表1和圖2～13。

圖2 ：乳腺癌MCF細胞種植裸鼠成瘤HE染色，細胞彌漫生長，部分區(qū)域可見壞死灶。圖3：高倍鏡下腫瘤細胞密集，核仁明顯，偶見核分裂象。圖4：免疫組化CKpan標記，腫瘤細胞強陽性，周邊脂肪細胞陰性，印證腫瘤細胞上皮來源。圖5-6：對照組及觀察組腫瘤免疫組化Ki67標記。圖7-8：對照組及觀察組腫瘤免疫組化CyclinD1標記。圖9-10：對照組及觀察組腫瘤免疫組化VEGF染色，腫瘤胞漿深淺不等褐染。圖11-13：腫瘤血管內(nèi)皮CD34標記，其中11為對照組腫瘤內(nèi)血管以小血管為主，管腔不規(guī)則，內(nèi)皮細胞部分核較大；圖12為觀察組CD34染色；圖13為腫瘤周邊與脂肪組織交界處，可見脂肪中形態(tài)溫和血管

表1 觀察組和對照組免疫指標評分比較（）

表1 觀察組和對照組免疫指標評分比較（）

組別 觀察組（n=10） 對照組（n=10） t值 P值CyclinD1（%） 19.8000±3.76534 15.6000±1.77639 2.957 0.016 Ki67（%） 35.6000±5.6112 29.9000±4.30633 2.703 0.024 VEGF 8.7000±01.63639 7.4000±1.26491 2.899 0.018 CD34 87.0000±10.42433 79.4000±6.44981 2.403 0.040

3 討論

本研究MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠經(jīng)TAM灌胃治療21d后，觀察組和對照組直徑大小變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但細胞增殖指標及血管計數(shù)有變化，可能有以下原因：（1）每只小白鼠對腫瘤細胞的耐受程度不完全相同，處死前期大部分老鼠已經(jīng)出現(xiàn)極度消瘦﹑惡病質(zhì)現(xiàn)象，但有2只荷瘤裸鼠狀態(tài)基本正常。（2）每只荷瘤裸鼠對他莫昔芬的敏感性有輕微差異。（3）他莫昔芬臨床應用長期效果較好，本實驗可能時間較短。動物實驗將用藥外其它因素盡量保持一致，但實驗分組對照試驗與臨床用藥前后腫瘤大小的比較尚有一定的區(qū)別。

乳腺癌MCF-7裸鼠腫瘤組織常規(guī)病理HE染色顯示，腫瘤細胞彌漫生長，間質(zhì)較少，細胞多邊形，部分區(qū)域可見壞死灶，高倍鏡下可見腫瘤細胞核仁明顯，偶見核分裂象。腫瘤巨檢邊界尚清，但鏡下可明確腫瘤無包膜，免疫組化作CKpan標記顯示：腫瘤浸潤至周圍脂肪組織中，交界處褐色為腫瘤細胞，白色為脂肪組織，同時顯示了腫瘤細胞上皮來源特性。

細胞周期的啟動G1期的是關鍵，而CyclinD1是調(diào)控G1期的細胞周期素依賴激酶的調(diào)節(jié)因子。盧夢玲等［1］陳述CyclinD1的主要功能是促進細胞增殖，其過度表達可致細胞失控而惡性變。也有學者［2］證明阿司匹林聯(lián)合他莫昔芬可下調(diào)乳腺癌細胞周期蛋白D1并阻斷G0 / G1期細胞周期。Ki-67最早在1983年由Gerdes等［3］在檢測一種淋巴瘤細胞核抗原時發(fā)現(xiàn)的，其表達增強是細胞增生活躍的一個反映。余海等［4］報道乳腺癌新輔助化療后Ki67可有明顯降低。本資料研究荷瘤裸鼠乳腺癌經(jīng)TAM灌胃治療21d后與對照組比較增殖指標CyclinD1﹑Ki67的變化，二者的陽性表達均在細胞核，棕色至褐色不等，與對照組比較，TAM灌胃組增殖指標的表達評分均下降且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證明他莫昔芬對乳腺癌腫瘤細胞有抑制增殖的作用。

血管不但可以為腫瘤細胞提供需要的營養(yǎng)物質(zhì)，運走代謝產(chǎn)物，近年來對腫瘤血管的研究逐漸增多。VEGF 是乳腺癌血管新生過程中最重要的促血管生成因子之一，在多種腫瘤組織中均表達，而且VEGF表達的濃度可以作為腫瘤預后的先兆指標。有研究［5］表明他莫昔芬可抑制SK-BR-3 乳腺癌細胞株裸鼠血清中VEGF的分泌，降低腫瘤組織中VFGF的表達。還有研究［6］顯示在肝細胞癌的診治過程中，可以動態(tài)監(jiān)測血VEGF水平及蛋白表達水平，動態(tài)評估腫瘤的療效及進展。CD34分子是高度糖基化的跨膜糖蛋白，可以在血管內(nèi)皮中表達。有學者［7］指出CD34被稱為微血管密度研究的最佳標記物。本資料觀察組VEGF陽性表達在胞漿/膜，免疫組化結(jié)果表現(xiàn)為深淺不等的彌漫或成片的棕褐色，CD34表達在血管內(nèi)皮細胞呈陽性，結(jié)果顯示，觀察組與對照組比較表達水平均下調(diào)且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明他莫昔芬對腫瘤的血管生成有抑制作用。從血管指標CD34的免疫組化結(jié)果分析，腫瘤組織中的微血管密度大，尤其是腫塊周邊地區(qū)，中心部分可見小灶狀缺血壞死。腫瘤血管形態(tài)極不規(guī)則，多為分支狀，內(nèi)皮細胞增生活躍，腫瘤表面的脂肪組織中血管密度明顯降低，且多為薄壁略擴張的小血管，形態(tài)較溫和。VEGF腫瘤細胞幾乎全部為陽性表達，所以免疫組化評分主要依賴色差。由于免疫組化染色的深淺容易受多種因素的干擾，故采用免疫組化方法判定腫瘤血管的變化VEGF并非最理想指標。

綜上所述，CyclinD1﹑Ki67通過促進腫瘤細胞的增殖而促進癌的生長發(fā)展，VEGF﹑CD34通過血管內(nèi)皮細胞的增殖，提高內(nèi)皮細胞通透性來促進“養(yǎng)料”的運輸﹑腫瘤的轉(zhuǎn)移。TAM作為乳腺癌內(nèi)分泌藥物，除了與腫瘤細胞競爭雌激素受體，使腫瘤細胞“養(yǎng)分”減少而直接抑制腫瘤細胞外，還可以抑制微血管的生成，減少腫瘤“養(yǎng)分”的運輸，期望對未來腫瘤實驗室及臨床診治提供新的診療途徑。

［1］ 盧夢玲,閆超,賴多,等．Cyclin D1與細胞周期調(diào)控．生物技術(shù)通報,2011,11(10):55-59．

［2］ Cheng R,Liu YJ,Cui JW,et al．Aspirin regulation of c-myc and cyclinD1 proteins to overcome tamoxifen resistance in estrogen receptor-positive breast cancer cells．Oncotarget,2017,8(18):30252．

［3］ Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al．Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation．Int J Cancer,1983,31(1):1．

［4］ 余海云,李文萍,郜紅藝,等．新輔助化療療效與乳腺癌Ki67、P53表達的關系．中華乳腺病雜志(電子版),2011,5(3):297-305．

［5］ 趙明智．他莫昔芬對SK-BR-3乳腺癌細胞株荷瘤裸鼠血管生成的作用及機制研究．河北大學,2015．

［6］ Liu K,Min XL,Peng J,et al．The Changes of HIF-1 and VEGF expression after tace in patients with hepatocellular carcinoma．Journal of Clinical Medicine Research, 2016, 8(4): 297-302．

［7］ Xiangyi Kong, Jian Guan, Wenbin Ma, et al． CD34 Over-Expression is Associated With Gliomas' Higher WHO Grade．Medicine, 2016,95(7):e2830．