馮祁軍 范存義 劉師良 吳可沁 徐龍生

異位骨化是指在正常情況不具有骨化性質(zhì)的組織中出現(xiàn)骨形成［1］。其嚴(yán)重影響患者肢體功能的恢復(fù)，包括繼發(fā)于肌肉﹑骨骼損傷后的異位骨化，目前尚無(wú)理想的預(yù)防和治療方法。護(hù)骨素（OPG）和核因子-КB受體活化因子配體（RANKL）是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和活性的重要因子，OPG/RANKL系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨質(zhì)代謝最后的共同通路［2］。然后，OPG/RANKL系統(tǒng)在異位骨化中的作用尚未明確。本研究通過(guò)Michelsson模型［3］誘導(dǎo)新西蘭實(shí)驗(yàn)兔形成異位骨化，并采用免疫組化染色對(duì)異位骨化標(biāo)本中OPG和RANKL的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討OPG/RANKL系統(tǒng)在創(chuàng)傷后異位骨化形成機(jī)制中的表達(dá)與作用。

1 臨床資料

1.1 異位骨化模型的建立 由嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康的SPF級(jí)雄性新西蘭實(shí)驗(yàn)兔30只，體重為2.5～3.0kg，新西蘭實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，第1天實(shí)驗(yàn)兔用3%戊巴比妥鈉麻醉，首先進(jìn)行正側(cè)位股骨X線攝片確保實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)無(wú)異位骨化存在。將30只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為兩組，模型組20只，對(duì)照組10只。模型組每只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔每天最大范圍活動(dòng)膝關(guān)節(jié)5min，活動(dòng)后用石膏固定右膝和右踝關(guān)節(jié)（石膏繃帶制成13～15cm長(zhǎng)，10～12層厚，前窄后寬的3/4管狀石膏條帶），右髖關(guān)節(jié)不固定，石膏干固后將實(shí)驗(yàn)兔放回籠內(nèi)，單籠飼養(yǎng)，強(qiáng)力按摩與固定操作6d/周，持續(xù)5周。對(duì)照組10只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔不干預(yù)，作為空白對(duì)照。

1.2 異位骨化標(biāo)本收集及免疫組化染色 在造模后的第8周，攝右股骨正側(cè)位X線片，評(píng)價(jià)異位骨化的進(jìn)展及排除骨折等損傷。處死所有實(shí)驗(yàn)兔并快速取出異位骨化組織，收集對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔正常的組織標(biāo)本作為對(duì)照。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，10% EDTA溶液脫鈣7～10d，石蠟整體包埋，做層厚為5μm切片。每個(gè)標(biāo)本取連續(xù)的兩張切片鋪于同一塊載玻片上，分別標(biāo)記為OPG和RANKL，分別用于做OPG 和RANKL免疫組化染色，一抗分別為兔抗兔OPG抗體和兔抗兔RANKL抗體（均購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司）。主要操作步驟：石蠟切片脫蠟水化，高溫抗原修復(fù)3min，3%過(guò)氧化氫封閉10min，分別滴加OPG和RANKL一抗（稀釋濃度均為1：150），室溫孵育1h，滴加二抗（稀釋濃度為1：200），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并判定結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定方法 每例標(biāo)本切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野下進(jìn)行結(jié)果判定，同一載波片上OPG和RANKL染色選取相同位置的高倍視野，按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比進(jìn)行綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：＜5%時(shí)計(jì)為0分，5%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，＞50%計(jì)為3分；染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分相乘即得出OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平的綜合評(píng)分。取5個(gè)高倍視野綜合評(píng)分的平均分值作為OPG和RANKL最終的表達(dá)水平，并計(jì)算OPG平均分值和RANKL平均分值的比值，即為OPG/RANKL比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位骨化造模結(jié)果 對(duì)照組10只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔全部存活至造模后第8周。模型組20只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔中，有2只于造模時(shí)因麻醉過(guò)量死亡，1只于造模后1周因組織感染死亡，共有18只實(shí)驗(yàn)兔存活至造模后8周。造模后第8周，對(duì)照組未見(jiàn)異位骨化形成（見(jiàn)圖1）；模型組存活實(shí)驗(yàn)兔中，共有14只（77.8%）形成異位骨化（見(jiàn)圖2）。

圖1 對(duì)照組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔右股骨未見(jiàn)異位骨化形成

圖2 模型組新西蘭實(shí)驗(yàn)兔右股骨可見(jiàn)異位骨化形成

2.2 免疫組化結(jié)果 對(duì)異位骨化組14只異位骨組織標(biāo)本和對(duì)照組的10只正常組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，陽(yáng)性表達(dá)著色，陰性對(duì)照不著色。標(biāo)本中OPG和RANKL陽(yáng)性表達(dá)均定位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色，陽(yáng)性染色細(xì)胞主要為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，呈團(tuán)狀或條帶狀分布，著色強(qiáng)度不一。分別對(duì)異位骨化OPG表達(dá)水平﹑RANKL表達(dá)水平和OPG/RANKL比值分別進(jìn)行比較，具體結(jié)果見(jiàn)表1。免疫組化圖見(jiàn)圖3～6。

表1 異位骨組織中的OPG、RANKL 表達(dá)水平比較（）

表1 異位骨組織中的OPG、RANKL 表達(dá)水平比較（）

組別 n OPG RANKL OPG/RANKL模型組 14 4.93±0.66 2.89±0.09 1.86±0.27對(duì)照組 10 3.49±0.08 3.01±0.16 1.19±0.47 t值 2.268 0.655 2.353 P值 0.012 0.537 0.023

圖3 對(duì)照組異位骨組織的OPG 表達(dá)（IHC，10×40）

圖4 模型組異位骨組織的OPG 表達(dá)（IHC，10×40）

圖5 對(duì)照組異位骨組織的RANKL表達(dá)（IHC，10×40）

圖6 模型組異位骨組織的RANKL表達(dá)（IHC，10×40）

3 討論

異位骨化初期的組織學(xué)特征為成纖維細(xì)胞活動(dòng)增加及纖維組織異常增生，繼而出現(xiàn)細(xì)胞和血管形成減少，玻璃樣變性形成；最終導(dǎo)致廣泛的鈣質(zhì)沉積以及新骨形成。骨質(zhì)重塑的過(guò)程主要由破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞這一成對(duì)的﹑相偶聯(lián)的細(xì)胞活動(dòng)主導(dǎo)，破骨細(xì)胞促使鈣質(zhì)釋放和骨質(zhì)吸收，成骨細(xì)胞促使鈣質(zhì)沉積和新骨形成，正常情況下兩者活動(dòng)維持在一定的平衡水平［4］。

OPG和RANKL均主要由成骨細(xì)胞﹑基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在骨骼﹑骨髓以及淋巴組織中的表達(dá)水平較高［5］，OPG的主要作用在于抑制破骨細(xì)胞的活性及功能，從而下調(diào)骨質(zhì)吸收，促進(jìn)鈣化過(guò)程及骨質(zhì)形成；RANKL的主要作用為刺激破骨細(xì)胞的分化和活性，抑制破骨細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)骨質(zhì)破壞和吸收［6］。RANKL主要通過(guò)與破骨細(xì)胞前體及成熟破骨細(xì)胞表面的受體核因子-КB受體活化因子（RANK）結(jié)合，刺激破骨細(xì)胞的分化﹑活性以及抑制破骨細(xì)胞的凋亡；而OPG作為誘餌受體可與RANKL發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止RANKL與其受體RANK的相互作用，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和活性［7］。因此，OPG/RANKL比值是決定骨質(zhì)重塑方向的關(guān)鍵因素，OPG/RANKL比值降低可促進(jìn)骨質(zhì)的破壞和吸收，OPG/RANKL比值升高則可促進(jìn)鈣質(zhì)沉積和骨質(zhì)形成。

OPG/RANKL系統(tǒng)在創(chuàng)傷后異位骨化過(guò)程中同樣扮演著重要角色。OPG主要由新生骨組織間成骨細(xì)胞表達(dá)并與鈣質(zhì)沉積的部位關(guān)系密切，提示OPG可能參與創(chuàng)傷后異位骨化形成過(guò)程。本研究對(duì)新西蘭實(shí)驗(yàn)兔異位骨化模型組織標(biāo)本中OPG和RANKL進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)了異位骨組織有OPG和RANKL陽(yáng)性表達(dá)，主要位于骨祖細(xì)胞﹑成骨細(xì)胞﹑成纖維細(xì)胞及破骨細(xì)胞包漿內(nèi)。通過(guò)對(duì)異位骨化組織和正常組織中的OPG和RANKL表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)異位骨化組織中的OPG表達(dá)水平明顯增加，而且OPG/RANKL的比值也顯著升高。以上結(jié)果表明，OPG/RANKL系統(tǒng)可能在異位骨化形成過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；OPG的表達(dá)增加以及OPG/RANKL比值增加，對(duì)異位骨化的形成和發(fā)展可能存在促進(jìn)作用。在各種炎癥細(xì)胞和因子的作用下，纖維細(xì)胞異常增生，OPG 合成增加及OPG/RANKL比值增加，從而抑制了破骨細(xì)胞的分化和活性，使成骨活動(dòng)得到增強(qiáng)，鈣質(zhì)沉積和新骨形成增加，最終導(dǎo)致異位骨化的形成。

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