吳中杰 胡奕 張雁飛 苗瀛 吳滌樊 徐荻★

近年來(lái)我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率和病死率持續(xù)走高［1］，DC- CIK細(xì)胞是從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）通過(guò)IL-2﹑GM-CSF﹑IL-4等細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增出樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），并與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的對(duì)腫瘤細(xì)胞具有非特異性殺傷活性的免疫細(xì)胞［2］。CIK是一群異質(zhì)T細(xì)胞，其殺腫瘤效應(yīng)細(xì)胞為同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞CD3和NK細(xì)胞CD56表型的NK樣T淋巴細(xì)胞，具有NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)［3-4］。研究表明［5-7］，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）對(duì)腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展﹑侵襲﹑轉(zhuǎn)移﹑復(fù)發(fā)﹑分期有重要意義并可用作指導(dǎo)分子靶向治療的標(biāo)志物。在體外將抗CD3單克隆抗體與抗EGFR單克隆抗體偶聯(lián)成對(duì)CD3 分子和EGFR具有雙重結(jié)合活性的雙特異性抗體，并對(duì)其體外抗腫瘤活性和對(duì)晚期肺癌患者的臨床治療安全性進(jìn)行了觀察，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 抗CD3單克隆抗體購(gòu)自TONBO生物科學(xué)公司（OKT3克?。?，人源化抗EGFR單克隆抗體（cetuximab）購(gòu)自美國(guó)默克公司，蛋白交聯(lián)試劑Traut's reagent和Sulfo-SMCC購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司，抗CD3﹑抗CD56﹑抗CD4﹑抗CD8﹑抗TgG等流式抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司，肺癌A549腫瘤細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞保藏中心，CCK8購(gòu)自同仁化學(xué)研究所。

1.2 方法 （1）抗CD3-EGFR雙特異性抗體的偶聯(lián)和純化：根據(jù)美國(guó)賽默飛世爾科技公司蛋白交聯(lián)試劑方法用Traut's reagent和Sulfo-SMCC試劑偶聯(lián)抗CD3單克隆抗體和抗EGFR單克隆抗體，偶聯(lián)產(chǎn)物用瓊葡糖凝膠柱（superose 6）進(jìn)行純化，獲得純度＞90%的二聚體，即為抗CD3-EGFR雙特異性抗體。（2）DCCIK細(xì)胞制備及檢測(cè)：采集患者外周血50ml，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離出PBMC，取PBMC接種至GT551無(wú)血清培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml， 添 加 IFN-γ（1000U/ml）﹑IL-2（500U/ml）﹑ 抗CD3 單抗（20ng/ml）﹑IL-4（1000U/ml）﹑GM-CSF（500U/ml），在37℃﹑5%CO2條件下培養(yǎng)，5d后即可誘導(dǎo)出未成熟DC細(xì)胞，加入TNF-α（500U/ml）使DC成熟。7d后加入含IL-2（500U/ml）的培養(yǎng)液隔天傳代培養(yǎng)7～10d，即得DC-CIK細(xì)胞，收集細(xì)胞（專(zhuān)利技術(shù)：201310102720.4）。將培養(yǎng)14d的DC-CIK細(xì)胞與熒光標(biāo)記抗人CD分子單抗孵育，再通過(guò)流式細(xì)胞分析測(cè)試免疫效應(yīng)細(xì)胞CD3﹑CD56﹑CD4﹑CD8的陽(yáng)性百分率。（3）DC-CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤A549腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)：將A549細(xì)胞接種于96孔板（每孔20000個(gè)/100μl），接種4h后加入對(duì)應(yīng)數(shù)量的DC-CIK細(xì)胞，共培養(yǎng)過(guò)夜（約16～18h），用PBS洗板后加入CCK8用酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。（4）抗CD3-EGFR雙特異性抗體標(biāo)記DC-CIK免疫細(xì)胞制備：將誘導(dǎo)擴(kuò)增后達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的DC-CIK細(xì)胞離心去除培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌一遍，加入合適劑量的雙特異性抗體37℃孵育30min后，用醫(yī)用生理鹽水注射液洗滌2次，并取樣檢測(cè)對(duì)腫瘤A549細(xì)胞的殺傷活性。細(xì)胞最后用醫(yī)用生理鹽水懸浮并加入人血清白蛋白至2%濃度制成注射懸液。DC-CIK細(xì)胞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞數(shù)量＞1×109/100ml；②T細(xì)胞數(shù)量（CD3+）＞90%；③NK樣T細(xì)胞數(shù)量（CD3+CD56+）＞30%；④對(duì)EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞殺傷活性（效靶比 10：1）＞50%；⑤細(xì)胞存活率測(cè)定＞90%；⑥細(xì)胞內(nèi)毒素＜0.5EU/ml。此外細(xì)胞需進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)﹑真菌檢測(cè)﹑放線(xiàn)菌檢測(cè)﹑革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌檢測(cè)和支原體檢測(cè)，應(yīng)符合規(guī)定。（5）臨床部分：通過(guò)將檢驗(yàn)合格的抗CD3-EGFR雙特異性抗體標(biāo)記的DC-CIK免疫細(xì)胞回輸患者，觀察輸注過(guò)程中及輸注后反應(yīng)，評(píng)估其臨床安全性，同時(shí)回輸治療前后通過(guò)KPS評(píng)分及影像學(xué)檢查﹑實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的比較，評(píng)估其療效。

2 結(jié)果

2.1 CD3-EGFR雙特異性抗體的制備和鑒定 用Traut's reagent和Sulfo-SMCC試劑偶聯(lián)抗CD3抗體和抗EGFR單抗，偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，拍照進(jìn)行灰度掃描（灰度掃描儀：CLINX Science Instrument，Gel documentation system），分子量在300KDa左右的單克隆抗體二聚體含量＞20%，見(jiàn)圖1。偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行瓊葡糖凝膠柱純化，收集不同波段樣品并進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)收集雙特異性抗體的純度，見(jiàn)圖2；將純度最高的27﹑28﹑29﹑30號(hào)樣品合并，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，無(wú)菌過(guò)濾儲(chǔ)存以備細(xì)胞標(biāo)記所用。

2.2 抗CD3-EGFR雙特異性抗體標(biāo)記DC-CIK細(xì)胞前后對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 從外周血分離PBMC誘導(dǎo)DC-CIK細(xì)胞對(duì)A549腫瘤細(xì)胞的殺傷活性在10：1的效靶比前提下，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為達(dá)到殺傷率＞50%。圖3中3例患者普通DC-CIK細(xì)胞的殺傷活性分別為51.8%﹑50.3%﹑51.6%；用抗CD3-EGFR雙特異性抗體標(biāo)記后DC-CIK細(xì)胞的殺傷活性顯著提升，3例患者的DCCIK細(xì)胞經(jīng)雙特異性抗體標(biāo)記后對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性達(dá)到82.0%﹑81.3%和96.1%。

圖1 雙特異性抗體偶聯(lián)前后電泳圖

圖2 偶聯(lián)產(chǎn)物分子篩純化前后非變性聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳圖。（樣品27、28、29、30灰度掃描純度＞90%）

圖3 雙特異性標(biāo)記前后DC-CIK細(xì)胞對(duì)肺癌A549細(xì)胞（EGFR陽(yáng)性）的殺傷率，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的效靶比為10：1

2.3 臨床安全性觀察及研究 在本次研究中，對(duì)15例晚期肺癌患者進(jìn)行了48人次的回輸治療，其中有3人次在輸注時(shí)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫37.5℃～38.4℃，予對(duì)癥用藥后體溫恢復(fù)正常，無(wú)惡心嘔吐﹑腹痛腹瀉﹑皮膚瘙癢﹑皮疹等其他不良反應(yīng)。治療期間，影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)未見(jiàn)患者出現(xiàn)明顯腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，同時(shí)KPS評(píng)分15例病例中有11例KPS評(píng)分有10～20分的提高，4例評(píng)分未改變，無(wú)評(píng)分下降病例。

3 討論

研究證明固有免疫系統(tǒng)的NK細(xì)胞可以識(shí)別并殺傷對(duì)化療和放療均不敏感的腫瘤干細(xì)胞，因此，NK細(xì)胞﹑NK樣T細(xì)胞的非特異性細(xì)胞免疫治療技術(shù)在腫瘤的綜合治療中起到更重要的作用。但是NK類(lèi)細(xì)胞治療依然存在靶向性不能覆蓋所有腫瘤細(xì)胞的問(wèn)題。NK細(xì)胞通過(guò)識(shí)別靶細(xì)胞NKG2D配體而誘發(fā)殺傷活性，突變的腫瘤細(xì)胞MHC classⅠ表達(dá)下調(diào)，NKG2D配體增加，從而誘發(fā)NK細(xì)胞的非特異殺傷活性，但是有些腫瘤細(xì)胞通過(guò)胞外小體分泌大量的可溶性NKG2D配體，或在免疫壓力下以其它方式改變細(xì)胞表面的分子表達(dá)，逃避非特異免疫細(xì)胞的攻擊。因此以NK樣T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的DC-CIK細(xì)胞臨床治療效果仍有限。

作者將抗CD3單克隆抗體與抗EGFR單克隆抗體偶聯(lián)成對(duì)CD3 分子和EGFR具有雙重結(jié)合活性的雙特異性抗體，并將其與DC-CIK細(xì)胞孵育，由于DCCIK細(xì)胞大部分為表達(dá)CD3分子的T淋巴細(xì)胞，抗CD3-EGFR雙特異性抗體通過(guò)與CD3抗原結(jié)合，將抗EGFR抗體標(biāo)記至DC-CIK細(xì)胞表面，使DC-CIK細(xì)胞對(duì)EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞具有靶向性，從而顯著提高DC-CIK細(xì)胞對(duì)表達(dá)EGFR腫瘤的殺傷活性。體外效靶細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明殺傷活性提高了近1倍。相比其他的細(xì)胞免疫治療，該技術(shù)具有更好的靶向性，能起到更好的治療療效，為細(xì)胞免疫治療提供了一種新的方法。

偶聯(lián)于DC-CIK細(xì)胞上的抗體，在臨床單獨(dú)使用時(shí)劑量每次在幾百毫克以上，毒副作用較大，而用于偶聯(lián)標(biāo)記DC-CIK上的抗體劑量?jī)H為數(shù)毫克，劑量相比非常微小，因此，作者推測(cè)用此雙特異性抗體標(biāo)記的DC-CIK細(xì)胞在體內(nèi)有較好的安全性。結(jié)合臨床觀察，輸注過(guò)程中僅有輕微發(fā)熱，無(wú)明顯其他不良反應(yīng)，所以提示具有較好的安全性。目前觀察經(jīng)過(guò)輸注，治療期間腫瘤穩(wěn)定，未見(jiàn)明顯進(jìn)展，但臨床遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步追蹤隨訪(fǎng)。

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