尚畫雨, 張 荷, 夏 志, 周 越, 王瑞元

(1. 成都體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，四川 成都 610041；2. 北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；3. 井岡山大學(xué) 體育學(xué)院，江西 吉安 343009)

骨骼肌是人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的動(dòng)力來源。長時(shí)間和(或)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，特別是離心運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌纖維會(huì)出現(xiàn)損傷(exercise-induced muscle damage,EIMD)，可造成延遲性肌肉酸痛(delayed onset muscle soreness,DOMS)和肌力下降，從而影響人體的運(yùn)動(dòng)和日常生活。一直以來，EIMD都是運(yùn)動(dòng)生理學(xué)和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)課題。研究表明，骨骼肌細(xì)胞凋亡[1]、自噬[2]與壞死[3]在EIMD過程中均有出現(xiàn)，其中細(xì)胞自噬是關(guān)鍵的細(xì)胞降解過程，可選擇性清除受損線粒體等細(xì)胞器以延緩細(xì)胞衰老[4-5]以及抑制細(xì)胞凋亡[6]，并通過線粒體自噬而作用于線粒體質(zhì)量控制(mitochondrial quality control,MQC)。

線粒體自噬(mitophagy)是指在活性氧(reactive oxygen species,ROS)、細(xì)胞衰老、營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激作用下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體出現(xiàn)去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進(jìn)入自噬體中，并與溶酶體融合后降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]，自噬體特征蛋白為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)。為適應(yīng)機(jī)體代謝需求，自噬引起的線粒體選擇性減少與線粒體生物發(fā)生相互作用，從而保持線粒體數(shù)量的穩(wěn)定。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體分裂要早于線粒體自噬，損傷的線粒體分裂為易被包裹的片斷后被選擇性地自噬清除，從而控制線粒體的質(zhì)量[8]。此外，正常情況下已損傷的線粒體可與鄰近的、完整的線粒體融合，并恢復(fù)其功能。然而，當(dāng)線粒體損傷程度超過其修復(fù)能力時(shí)，線粒體自噬啟動(dòng)，清除受損線粒體[9]。以上研究提示，線粒體自噬與線粒體生物發(fā)生、線粒體動(dòng)態(tài)變化、線粒體修復(fù)共同參與MQC，對(duì)線粒體數(shù)量與功能的維持具有重要作用。

目前，對(duì)骨骼肌線粒體自噬的相關(guān)研究較鮮見，對(duì)骨骼肌細(xì)胞中線粒體自噬的變化情況及其誘導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不明確。線粒體自噬的直接動(dòng)力來自于線粒體自噬蛋白及其相關(guān)的受體蛋白，研究線粒體自噬蛋白及其相關(guān)蛋白在運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相的變化尤為必要，可在進(jìn)一步證明大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘發(fā)線粒體自噬的同時(shí)，有助于探明骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化是否與線粒體自噬的發(fā)生有某種關(guān)聯(lián)。目前的研究表明，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，除Nix、Bnip3和FUNDC1是與低氧環(huán)境關(guān)系密切的線粒體自噬途徑外，介導(dǎo)包括骨骼肌線粒體自噬途徑的主要為PINK1/Parkin[10-11]。其中PINK1(PTEN-induced putative kinase protein 1)位于Parkin(Parkinson protein 2,E3 ubiquitin protein ligase)上游，PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)了受損線粒體表面結(jié)構(gòu)或功能蛋白的多聚泛素化，并以此作為被自噬體選擇包裹的標(biāo)志，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬依賴的對(duì)去極化線粒體的降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12-14]。然而，目前尚未見從PINK1/Parkin途徑探究大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷動(dòng)物模型，觀察線粒體自噬蛋白PINK1/Parkin及其介導(dǎo)的自噬體膜標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)變化，明確是否發(fā)生了線粒體自噬；再進(jìn)一步分析骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化是否與線粒體自噬的發(fā)生有某種關(guān)聯(lián)，且這種關(guān)聯(lián)是否通過PINK1/Parkin途徑誘發(fā)；此外，從分子水平上探討大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體質(zhì)量為(212.19±6.64) g(動(dòng)物等級(jí)為SPF級(jí)，使用許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)。用標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料分籠飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房內(nèi)，獲得北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，保持室內(nèi)相對(duì)濕度為40%～70%，溫度為20～26 ℃，室內(nèi)12 h明暗自動(dòng)切換，自由攝食、飲水。

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為對(duì)照組(control,C)和運(yùn)動(dòng)組(exercise,E)。其中，E組根據(jù)運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)又分為運(yùn)動(dòng)后即刻組(E0)、運(yùn)動(dòng)后12 h組(E12)、運(yùn)動(dòng)后24 h組(E24)、運(yùn)動(dòng)后48 h組(E48)和運(yùn)動(dòng)后72 h組(E72)，每組8只。

1.2運(yùn)動(dòng)方案使用小動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。所有運(yùn)動(dòng)組大鼠在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練 3 d，具體方案如下：第1天跑臺(tái)坡度為0°，速度為16 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為5 min；第2天跑臺(tái)坡度為0°，速度為16 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為10 min；第3天休息。適應(yīng)訓(xùn)練后的第2天開始正式實(shí)驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)方案參照Armstrong[15]的離心運(yùn)動(dòng)模型，采取持續(xù)性下坡跑，跑臺(tái)坡度為- 16°，速度為16 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為90 min。

1.3取材及樣品制備按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)，將大鼠分批稱重后于腹腔內(nèi)注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血后迅速分離大鼠比目魚肌，剪取約1 mm×1 mm×1 mm的小塊比目魚肌放入預(yù)冷至4 ℃的體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定液中，用于電鏡檢測(cè)；再切取100 mg新鮮的比目魚肌放入離心管內(nèi)稱重后，按照碧云天動(dòng)物組織線粒體分離試劑盒(C3606)說明書差速離心提取骨骼肌線粒體，隨后加入適量的線粒體儲(chǔ)存液，重懸線粒體以待測(cè)線粒體酶活性，另加入適量臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體，以測(cè)線粒體蛋白表達(dá)；最后，用錫紙包裹剩余的比目魚肌并將其置于液氮中，之后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.4測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 采用透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 將比目魚肌從戊二醛固定液中取出，首先用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，再用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定，然后用0.1 mol/L的磷酸緩沖液再次沖洗，之后進(jìn)行脫水處理(乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%、100%)，然后用環(huán)氧樹脂Spurr將其包埋，再將其縱切制成超薄切片，待樣品干燥后采用透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

對(duì)于每一張組織切片，先在低倍視野(×500～×1 000)下確定觀察區(qū)域，之后在高倍視野(×2 000-×8 000)下觀察其超微結(jié)構(gòu)，主要觀察線粒體的分布、大小、形態(tài)以及嵴的結(jié)構(gòu)、自噬體的形成變化。隨機(jī)拍攝肌膜下和肌原纖維間照片各10張，每組每個(gè)部位下骨骼肌線粒體照片共30張[16]。使用IPP6.0圖像分析軟件測(cè)定線粒體的數(shù)量。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)比目魚肌線粒體CS的含量 CS是線粒體數(shù)量的定量酶標(biāo)。采用大鼠檸檬酸合成酶(CS) ELISA分析試劑盒(美國USCNLIFE公司)檢測(cè)酶的含量。檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法測(cè)定比目魚肌PINK1及線粒體Parkin、LC3的蛋白含量 將稱取的各組(每組n=6)比目魚肌置于研缽中，加入液氮，將組織研磨成粉末，然后按照1 mg組織加入10 μL裂解液的比例進(jìn)行裂解，再置于離心機(jī)內(nèi)(參數(shù)：4 ℃、12 000g)離心10 min，取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后統(tǒng)一調(diào)整，使上樣量保持一致。然后，以4∶1比例加入5倍上樣緩沖液，在98 ℃下煮沸5 min后分裝樣品保存。

取樣品加樣：樣品體積20 μL/孔，蛋白的質(zhì)量濃度1.5 μg/μL。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜，封閉經(jīng)一二抗孵育后放入凝膠成像系統(tǒng)(美國 BIO-RAD 公司)中顯像。所用抗體為：Anti-PINK1和Anti-Parkin及Anti-LC3及Anti-COXⅣ(英國 Abcam 公司)、Anti-GAPDH(美國 Santa Cruz 公司)、Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP和Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。使用Gel-pro軟件分析蛋白條帶灰度值，蛋白表達(dá)量用“目的蛋白/內(nèi)參”計(jì)算，即骨骼肌目的蛋白PINK1/內(nèi)參GAPDH、骨骼肌線粒體目的蛋白(Parkin、LC3)/內(nèi)參COXⅣ。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用IPP圖片分析軟件對(duì)所獲得的電鏡圖片進(jìn)行定量分析。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示。進(jìn)行方差分析之前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，則采用LSD法進(jìn)行事后檢驗(yàn)；若方差不具齊性，則將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換至齊性后再作統(tǒng)計(jì)。對(duì)于不能轉(zhuǎn)換至齊性的數(shù)據(jù)直接用Tamhane’s T2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相線粒體超微結(jié)構(gòu)與自噬體的變化

2.1骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化本實(shí)驗(yàn)使用透射電鏡觀察了一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，如圖1所示。由圖1可見：C組大鼠骨骼肌中的線粒體小，且均勻分布于Z線兩側(cè)，肌膜下的線粒體較少；線粒體雙膜結(jié)構(gòu)清晰完整，嵴結(jié)構(gòu)飽滿密集，多呈細(xì)長桿狀和橢圓形，大小均一。經(jīng)過一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)后即刻組的骨骼肌線粒體分布不均勻，在肌膜下大量積聚[17]，此時(shí)線粒體開始變大、腫脹，大小不一，嵴結(jié)構(gòu)不清晰。運(yùn)動(dòng)后12 h，Z線部分?jǐn)嗔?，肌膜下線粒體大量積聚，線粒體腫脹，變圓，部分膜結(jié)構(gòu)不清晰，嵴變清晰但少而稀，此時(shí)線粒體損傷最為嚴(yán)重。運(yùn)動(dòng)后24 h，Z線較為清晰，肌膜下線粒體數(shù)量減少，線粒體形態(tài)有所恢復(fù)，雖然依舊很大很圓，但膜結(jié)構(gòu)較清晰，嵴變得多而密。運(yùn)動(dòng)后48 h，線粒體再次出現(xiàn)損傷表現(xiàn)，但線粒體損傷程度小于運(yùn)動(dòng)后12 h的表現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后72 h線粒體的形態(tài)已經(jīng)基本恢復(fù)到正常水平。進(jìn)一步觀察后還發(fā)現(xiàn)，C組大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)未觀察到明顯的自噬體(雙層膜結(jié)構(gòu))，經(jīng)過一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)有大量自噬體形成，出現(xiàn)了大量的處于不同成熟階段的自噬體[18](如圖1中箭頭所指)：在運(yùn)動(dòng)后即刻至12 h出現(xiàn)了早期的自噬小泡包裹尚可識(shí)別的線粒體，運(yùn)動(dòng)后24 h至48 h出現(xiàn)了后期的自噬小泡包裹薄層狀結(jié)構(gòu)，運(yùn)動(dòng)后72 h未觀察到明顯的自噬體。

各組大鼠肌膜下線粒體數(shù)量的計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與C組相比，E組各時(shí)相肌膜下線粒體數(shù)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中運(yùn)動(dòng)后24 h、72 h肌膜下線粒體數(shù)量明顯升高(P<0.05)[17](表1)。

表1 運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌膜下線粒體的數(shù)量

注： 與C組相比,*表示P<0.05,表2同此

2.2骨骼肌線粒體CS含量的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠比目魚肌線粒體中CS含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)。與C組相比，線粒體CS含量在運(yùn)動(dòng)后0 h明顯減少(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)后12 h有所增加，運(yùn)動(dòng)后24 h再次減少至最低(P<0.05，分別減少了45.8%、41.2%和50.1%)，運(yùn)動(dòng)后48 h和72 h逐漸增加，于運(yùn)動(dòng)后72 h達(dá)到最高，但尚未恢復(fù)至C組水平。

表2 運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌線粒體CS的含量

2.3骨骼肌PINK1和線粒體中Parkin、LC3蛋白表達(dá)的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2～圖4)，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，不同時(shí)相骨骼肌PINK1和線粒體中Parkin、LC3蛋白表達(dá)總體上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。首先，骨骼肌PINK1在運(yùn)動(dòng)后即刻至12 h逐漸升高，12 h組較C組顯著升高了1.55倍(P<0.05)，此時(shí)出現(xiàn)最高峰，此后逐漸下降。其次，線粒體中Parkin蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h和24 h均顯著性升高(P<0.01或P<0.05)，比C組分別增高了1.62倍、1.34倍和1.54倍，并持續(xù)維持在高水平，最高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后即刻；運(yùn)動(dòng)后48 h和72 h逐漸降低，運(yùn)動(dòng)后72 h恢復(fù)至C組水平，此時(shí)明顯低于運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h和24 h水平(P<0.01或P<0.05)。LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h和48 h較C組差異均具有顯著性(P<0.01或P<0.05)，比C組分別升高了1.14倍、1.76倍和82.7%，最高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后12 h，此時(shí)明顯高于運(yùn)動(dòng)后即刻水平(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)后24 h至72 h逐步回落，運(yùn)動(dòng)后72 h仍略高于C組。

圖2 運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌PINK1蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化

圖3 運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌線粒體Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化

圖4 運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌線粒體LC3蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化

3 分析與討論

3.1大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響骨骼肌損傷形態(tài)學(xué)研究是EIMD發(fā)生機(jī)制探索的基礎(chǔ)。研究表明，劇烈的、非習(xí)慣負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，尤其是離心運(yùn)動(dòng)[19-22]可引起骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。前期研究發(fā)現(xiàn)：一次離心運(yùn)動(dòng)后即刻肌纖維超微結(jié)構(gòu)的改變程度較小，運(yùn)動(dòng)后1～2 d變化程度逐漸加劇，并見炎癥細(xì)胞浸潤[20]；此外，4周離心運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致骨骼肌線粒體在肌膜下聚積，大小不一；肌纖維內(nèi)線粒體腫脹，嵴稀少，呈空泡化，表現(xiàn)出嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)異常[21]。李世成等[22]指出,骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷在離心運(yùn)動(dòng)后12～24 h最為嚴(yán)重，呈現(xiàn)明顯的線粒體腫脹、嵴紊亂等。故本實(shí)驗(yàn)參照Armstrong等[15]的運(yùn)動(dòng)方案對(duì)大鼠進(jìn)行一次持續(xù)性下坡跑，致使肌纖維損傷發(fā)生，復(fù)制出EIMD模型，選取運(yùn)動(dòng)后即刻(0 h)、12 h、24 h、48 h和72 h這5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，并提取離心運(yùn)動(dòng)最易損傷的慢肌(比目魚肌)進(jìn)行研究。筆者發(fā)現(xiàn)，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后比目魚肌線粒體出現(xiàn)明顯腫脹、肌膜下積聚等超微結(jié)構(gòu)異常變化，出現(xiàn)了大量的處于不同成熟階段的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，且運(yùn)動(dòng)后的這種變化具有明顯的時(shí)相性：運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌輕微損傷，線粒體開始變大、腫脹，嵴小部分缺損；隨著時(shí)間延長，損傷程度加深，運(yùn)動(dòng)后12 h的損傷最為嚴(yán)重，線粒體多見空泡變性、腫脹、嵴部分缺損、紊亂；運(yùn)動(dòng)后24 h有所緩解，至48 h出現(xiàn)“二次損傷”表現(xiàn)，但此時(shí)線粒體的損傷程度小于運(yùn)動(dòng)后12 h的表現(xiàn)；運(yùn)動(dòng)后72 h接近恢復(fù)至正常水平。此外，筆者發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后有大量自噬體形成，在運(yùn)動(dòng)后即刻和12 h表現(xiàn)為早期的自噬小泡包裹尚可識(shí)別的線粒體，在運(yùn)動(dòng)后24 h和48 h表現(xiàn)為后期的自噬小泡包裹薄層狀的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李世成等[22]的文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。

此外，研究證實(shí)EIMD的發(fā)生與骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體功能改變緊密相關(guān)，因此，研究運(yùn)動(dòng)對(duì)線粒體機(jī)能的影響越來越受人們的重視。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，線粒體的氧化磷酸化功能受損，表現(xiàn)為電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)和細(xì)胞色素C(cytochrome,Cyt C)蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)[21]。有報(bào)道指出，不同運(yùn)動(dòng)方式和負(fù)荷還能使線粒體數(shù)量和質(zhì)量發(fā)生變化，其中有氧耐力運(yùn)動(dòng)可以引起線粒體數(shù)量和體積的增加[23]，而一次或重復(fù)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)則會(huì)導(dǎo)致線粒體嚴(yán)重受損，線粒體數(shù)量減少[24-25]。在目前的離體及在體實(shí)驗(yàn)中，已將檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS)作為反映線粒體數(shù)量變化的客觀指標(biāo)[26-27]。研究證實(shí)，線粒體功能破壞，如呼吸鏈?zhǔn)芤种苹蛘適tDNA損耗均不會(huì)對(duì)CS造成影響，因此，CS的含量變化是定量線粒體的理想標(biāo)志[26-27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后線粒體內(nèi)CS的含量呈減少的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后24 h減少至最低(P<0.05)，此研究結(jié)果與董貴俊等[24]的報(bào)道基本一致，提示一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可顯著下調(diào)骨骼肌線粒體的數(shù)量。以上研究結(jié)果表明，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可致使骨骼肌線粒體受損，數(shù)量減少，導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化功能障礙。

3.2大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠骨骼肌損傷的可能機(jī)制研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)或骨骼肌收縮為骨骼肌乃至整個(gè)機(jī)體帶來積極的健康效益的同時(shí)也產(chǎn)生的許多負(fù)面效應(yīng)，如ROS的產(chǎn)生、非功能或損傷細(xì)胞組件(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等)的聚集、衰老或錯(cuò)誤折疊蛋白的累積等[28]，這些代謝廢物可通過細(xì)胞自噬轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)消化降解，從而完善肌細(xì)胞質(zhì)量控制[29]。為了維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)狀態(tài)，受損或多余的線粒體需要被及時(shí)清除，這主要通過自噬途徑實(shí)現(xiàn)(即線粒體自噬)[30]。在正常的生理?xiàng)l件下，線粒體自噬現(xiàn)象相對(duì)穩(wěn)定，但生理與病理狀態(tài)會(huì)誘發(fā)其增強(qiáng)或者減弱。

PINKl/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是近年來研究的熱點(diǎn)，但對(duì)其在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)線粒體自噬中扮演的角色仍知之甚少。Vainshtein等[31]認(rèn)為，一次力竭性運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌線粒體融合分裂和自噬能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為Parkin、Drp1表達(dá)上調(diào)。樊申元等[32]研究發(fā)現(xiàn)，帕金森小鼠PINK1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而8周耐力訓(xùn)練可上調(diào)其PINK1 mRNA、Parkin蛋白含量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，從而改善神經(jīng)線粒體功能。崔迪等[33]對(duì)小鼠進(jìn)行6周高脂膳食干預(yù)后，小鼠骨骼肌中的PINK1/Parkin、Nix/Bnip3信號(hào)在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上均存在不同程度的異常，但耐力訓(xùn)練可改善線粒體自噬水平，穩(wěn)定線粒體功能，而且PINK1/Parkin信號(hào)相對(duì)于Nix/Bnip3信號(hào)的變化在骨骼肌中更加敏感。崔迪等[34]還發(fā)現(xiàn)，P53抑制劑致使健康小鼠骨骼肌PINK1的轉(zhuǎn)錄異常高水平可通過耐力訓(xùn)練得到改善。以上說明，適度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可在一定程度上激活自噬水平，這有利于維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)以及介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)；當(dāng)不良應(yīng)激作用于機(jī)體時(shí)，自噬水平的過度激活可能會(huì)導(dǎo)致線粒體和細(xì)胞功能異常。

本研究觀察了一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠比目魚肌PINK1和線粒體中Parkin、LC3在不同時(shí)相的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示三者均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。自噬因子PINK1的蛋白表達(dá)水平和研究中線粒體損傷的情況基本一致。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)引起線粒體上降解PINK1的蛋白酶體催化作用被抑制，使得PINK1在線粒體上大量聚集，在12 h左右出現(xiàn)聚集的高峰，而此時(shí)正是本模型的骨骼肌細(xì)胞和線粒體損傷最為嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)。而此后的時(shí)相蛋白酶體作用開始活躍，減少了PINK1在線粒體上的累積，線粒體的結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，這與骨骼肌損傷恢復(fù)過程的時(shí)程也是基本吻合的。

此外，胞漿蛋白Parkin在線粒體中的表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后即刻至24 h顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05)，最高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后即刻，隨后48 h和72 h逐漸降低，提示一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)Parkin線粒體轉(zhuǎn)位增加。Kim等[35]指出，無論是PINK1和Parkin共表達(dá)還是Parkin定位于線粒體上表達(dá)都會(huì)引起線粒體大量聚集。綜合上述結(jié)果推測(cè)，正常情況下，Parkin游離于胞漿，一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致線粒體損傷后，PINK1隨即開始在線粒體上表達(dá)，經(jīng)過一系列作用加強(qiáng)了Parkin泛素連接酶的活性，使得大量Parkin從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體，二者可能參與了肌膜下線粒體的聚集過程。然而，PINK1如何募集Parkin到線粒體的分子機(jī)制仍不明確，另外大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)Parkin轉(zhuǎn)位從而啟動(dòng)線粒體自噬的分子機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。

此前通過電鏡觀察到線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化及線粒體自噬體的形成，僅能初步證明大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，需要進(jìn)一步結(jié)合自噬體標(biāo)記分子的蛋白水平表達(dá)才能確定大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)是否誘發(fā)了線粒體自噬。因此，采用Western Blot方法檢測(cè)自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3在線粒體中的表達(dá)。結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在運(yùn)動(dòng)后顯著上調(diào)，最高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后12 h，此后24 h至72 h逐步回落。由此可以看出，本研究結(jié)果與電鏡下觀察到的結(jié)果相符，表明大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可引起大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬體的積聚。結(jié)合線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可知，一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻，線粒體開始變大、腫脹，嵴結(jié)構(gòu)不清晰，此時(shí)也已經(jīng)出現(xiàn)了線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin和LC3表達(dá)上調(diào)，說明PINK1在線粒體上大量聚集，Parkin、LC3也定位至線粒體。運(yùn)動(dòng)后12 h發(fā)現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，此時(shí)的蛋白表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)的變化。透射電鏡觀察到線粒體在運(yùn)動(dòng)后即刻和12 h左右是損傷最為嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)PINK1、Parkin和LC3也分別出現(xiàn)表達(dá)的高峰。此后的時(shí)相蛋白酶體作用開始活躍，減少了PINK1在線粒體上的累積，胞漿中Parkin的轉(zhuǎn)位及自噬的發(fā)生相繼減少，線粒體的結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，這與骨骼肌損傷恢復(fù)過程的時(shí)程是基本吻合的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)了骨骼肌線粒體自噬的發(fā)生。

細(xì)胞死亡的方式主要可以分為三大類，即細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞自噬性死亡。目前，對(duì)于EIMD機(jī)理的研究主要基于以上3種死亡方式：①大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能通過上調(diào)Omi的表達(dá)，促進(jìn)XIAP與Omi相互結(jié)合，進(jìn)而激活Caspase-9和Caspase-3的活性，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一過程已在前期研究中證實(shí)[36]；②肌肉在離心運(yùn)動(dòng)中被過度拉伸后會(huì)丟失一些肌細(xì)胞膜蛋白，從而導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡或壞死[37]；③第3種死亡方式即自噬性死亡，這種細(xì)胞死亡方式往往伴有特征性雙層膜包裹的自噬體的形成，而目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中的Western Blot結(jié)果顯示，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，線粒體與自噬體膜標(biāo)記物L(fēng)C3結(jié)合增多，說明自噬體對(duì)待降解線粒體的識(shí)別和結(jié)合不存在障礙，線粒體自噬明顯被激活，而PINK1及其下游Parkin參與其中。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)線粒體自噬過度增加，增加的自噬體過度地與線粒體結(jié)合，這其中可能還包括很多健康的線粒體，致使線粒體數(shù)量顯著減少，細(xì)胞活力不能維持，最終引發(fā)自噬性細(xì)胞死亡或凋亡。目前，線粒體自噬性死亡已被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的形式之一[38-39]。據(jù)此推測(cè)，由大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)引起的線粒體自噬的程度可能是導(dǎo)致線粒體丟失，以及隨后的能量代謝障礙致使骨骼肌細(xì)胞損傷的一個(gè)重要因素。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致線粒體受損，因而誘導(dǎo)過度的線粒體自噬性清除，這可能會(huì)加重線粒體丟失，使得線粒體供能出現(xiàn)障礙，這一發(fā)現(xiàn)是對(duì)EIMD發(fā)生機(jī)制的重要探索，但仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證?；诖筘?fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)于線粒體自噬的影響，選擇有針對(duì)性的線粒體自噬抑制劑和其他干預(yù)方式進(jìn)行保護(hù)，有可能為預(yù)防EIMD提供新線索。

本文在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)了大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)損傷和數(shù)量減少，在分子水平上發(fā)現(xiàn)了大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)線粒體自噬過度發(fā)生，分析了線粒體自噬在運(yùn)動(dòng)致線粒體結(jié)構(gòu)數(shù)量丟失中的可能作用。以上結(jié)果表明，對(duì)于一次90 min的大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，隨著骨骼肌對(duì)大負(fù)荷的耐受性減弱，嵴的密集程度減弱，嵴的結(jié)果被破壞，線粒體數(shù)量減少，功能受損較重，在引發(fā)這些線粒體丟失現(xiàn)象的同時(shí)還誘導(dǎo)了線粒體自噬的過度發(fā)生，這可能是大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌損傷的重要原因之一。

4 結(jié)論

一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量均受損，有大量的自噬體形成，導(dǎo)致骨骼肌損傷，原因可能是大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)通過激活PINK1/Parkin信號(hào)介導(dǎo)線粒體自噬的過度發(fā)生，從而影響了線粒體的數(shù)量和功能；然而，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)胞漿Parkin實(shí)現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位及自噬的調(diào)控機(jī)制仍不明確，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步闡明。

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