房彬 ，張建 ，薛二軍 ，王連杰 ，劉建闊 ， 張慧

（1.天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300350；

2.天津創(chuàng)業(yè)環(huán)保集團(tuán)股份有限公司，天津300381；3.山東創(chuàng)業(yè)環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，山東臨沂276400）

伴隨氰化物大規(guī)模應(yīng)用而來的土壤氰化物污染問題，已成為當(dāng)今重大社會關(guān)切。氰化物在土壤中自然降解速率大大慢于天然水體中的降解速率，超過土壤凈化能力的氰化物在土壤中殘留、蓄積和運(yùn)移，成為環(huán)境的二次污染源，對水體、糧食生產(chǎn)及人類健康長期存在潛在危害，迫切需要修復(fù)治理。當(dāng)前,對含氰廢水的化學(xué)和生物方法處理已多有報道[1]，含氰土壤的修復(fù)方法主要有植物修復(fù)和化學(xué)修復(fù)[2，3]，而利用微生物手段修復(fù)氰化物污染土壤卻鮮有報道。研究通過為氰化物污染土壤生物修復(fù)篩選菌種資源，評估修復(fù)效果，嘗試為氰化物修復(fù)提供了經(jīng)濟(jì)有效的新思路，為優(yōu)化氰化物污染微生物修復(fù)工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 氰化物污染土壤室內(nèi)修復(fù)試驗

供試土壤取自天津港某?；穫}庫周邊,取樣深度為0～30 cm,把采集來的土樣盡快混勻，避光風(fēng)干，去除雜質(zhì)，粉碎，研磨到全部過孔徑18目篩。設(shè)置添加菌劑的修復(fù)處理和相應(yīng)不添加菌劑的對照處理：修復(fù)處理加入氰化物污染土壤樣品200 g，10%的比例接種混合降解菌，使用移液槍移取高純水至土壤含水量達(dá)到20%，攪拌均勻，稱重以便后期補(bǔ)水。對照處理不接種降解菌，含水量同樣調(diào)節(jié)至20%。將裝有污染土壤的培養(yǎng)燒杯在25℃人工氣候箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)失水量，每1 d補(bǔ)水并攪拌一次。

1.2 總氰化物測定

氰化物含量分析采用新鮮土樣，分光光度法測定[4]。

1.3 氰化物降解菌群馴化，鑒定及菌液配置

本研究組前期從鐵藍(lán)涂料的生產(chǎn)廢水中篩選馴化得到高效降氰菌群，具體步驟包括廢水水樣稀釋；涂布法分離純化耐氰菌種；不同濃度KCN培養(yǎng)基馴化耐氰細(xì)菌。根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特點，利用分子生物技術(shù)分析其群落結(jié)構(gòu)。根據(jù)試驗用接種量將選擇優(yōu)化出的菌群進(jìn)行放大培養(yǎng)，配制成菌液制劑。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌群對氰化物降解作用研究

將菌懸液按10%量接種到氰化物污染土壤，在試驗的 0，1，2，3，8 d 分別在試驗組和對照組取土壤測試。最初接種24 h內(nèi)，降氰菌發(fā)揮降氰作用較為迅速，延滯期較短，氰化物降解率達(dá)到26.9%，之后降解率增加緩慢，并趨于穩(wěn)定，第8 d累計降解率為33.3%（表1，圖1）。生物修復(fù)效果取決于生理和代謝中有能力在受污染環(huán)境中降解污染物微生物的存在；一方面，營養(yǎng)物質(zhì)對本研究降氰菌的生物降解產(chǎn)生了影響，另一方面，降氰菌群在培養(yǎng)條件下失去了競爭優(yōu)勢也是可能的原因。而對照區(qū)反映了沒有添加任何物質(zhì)土壤中氰化物含量變化，累計去除率在4%左右，說明在自然條件下土壤中氰化物降解是緩慢的，這和李社紅等人[5]的研究結(jié)論相符。

表1 不同處理土壤氰化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間變化 mg/kg

圖1 不同處理土壤氰化物降解率隨時間變化

2.2 降氰菌的篩選、馴化及生物學(xué)分類地位的確定

為進(jìn)一步提升菌群對氰化物的去除效果，利用分子生物技術(shù)分析其群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該菌群包括2種酵母菌（圖2a）和8種細(xì)菌（圖2b），其中細(xì)菌為水谷鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium mizutaii）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、惡 臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、無色桿菌屬（Achromobacter sp.）、類桿菌屬（Bacteroides sp.）和沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。Sphingobacterium mizutaii所占比例最高，達(dá) 61%，為該菌群的優(yōu)勢菌種。另外，菌種Ochrobactrum sp.，Pseudomonas putida和Klebsiella oxytoca在菌群中所占比例為8%～10%，屬于污水生物處理過程的中常見菌株，能夠降解包括喹啉在內(nèi)的多種芳香烴化合物。Alcaligenes sp.，Achromobacter sp.，Bacteroides sp. 和Serratia sp.在菌群中所占比例較低，僅為2%～3%，其中菌Alcaligenes sp.據(jù)報道可分泌中降氰酶[6]，能夠?qū)⑶杌锝到鉃镹H3，而Bacteroides sp.和Serratia sp.對鉻、錳等重金屬離子具有較強(qiáng)的耐受能力。此外該菌群中還包含兩種真核生物酵母菌，其中毛孢子菌屬（Trichosporon）在含氰廢水處理過程有過相關(guān)的應(yīng)用報道[7]。

圖2 氰降解菌群群落結(jié)構(gòu)組成

3 結(jié)論

試驗對鐵藍(lán)涂料的生產(chǎn)過程含氰廢水進(jìn)行菌群分離、馴化，最終確定細(xì)菌類的水谷鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium mizutaii）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）和真菌類的毛孢子菌屬（Trichosporon）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）等菌群。對這些菌群進(jìn)行放大培養(yǎng)，進(jìn)行氰化物污染土壤修復(fù)試驗研究。經(jīng)過8 d微生物修復(fù)試驗，土壤中的氰化物累計降解率達(dá)到33.3%，而對照區(qū)土壤中人為添加的氰化物含量變化不大，累計去除率在4%左右，說明在自然條件下土壤中氰化物降解是緩慢的。開展對土壤溫度、水分、氧和營養(yǎng)物質(zhì)等環(huán)境因素的調(diào)控作用研究，提高土壤氰化物降氰效率，是今后研究工作開展的重點。

[1] 張建，王萬超，李玉慶，等.工業(yè)廢水中氰化物的生物去除技術(shù)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(17):275-278.

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[3] 于曉章.氰化物污染的植物修復(fù)可行性研究[J].生態(tài)科學(xué)，2004，23(2):97-100.

[4]國家環(huán)境保護(hù)部.土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法：HJ745-2015[S].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2015.

[5] 李社紅，鄭寶山，朱建明，等.金礦尾礦渣及其污染土壤中氰化物的分布及自然降解[J].環(huán)境科學(xué)，2001，22(3):126-128.

[6]Dubey S，Holmes D.Biological cyanide destruction mediated by microorganisms[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，1995，11(3):257-265.

[7] 秦勝東，郭嘉 ，劉玉存，等.固定化微生物技術(shù)研究進(jìn)展及其在水處理中的應(yīng)用[J].水處理技術(shù)，2014(10):003.