何小三, 王 微, 肖清鐵,2, 鄭新宇,2, 鄭梅琴,2, 朱靜靜, 韓永明,汪敦飛, 林瑞余,2**, 林文雄,2

(1. 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350002; 2. 作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350002)

鎘(Cd)具有生物蓄積性強(qiáng)、毒性持久及“致突變、致畸、致癌”作用[1]。環(huán)境中的鎘極易通過生物循環(huán)進(jìn)入食物鏈, 進(jìn)而危害人體健康[2]。據(jù)2014年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào), 我國(guó)土壤 Cd污染面積達(dá)2×105km2, 約占耕地總面積的 1/6。我國(guó)已有 11個(gè)污水灌溉區(qū)的土壤鎘含量嚴(yán)重超標(biāo), 年產(chǎn)鎘米5×104t, 僅沈陽(yáng)市張士灌區(qū)就約有2 533 hm2的農(nóng)田遭受鎘污染, 其中 13%的面積為嚴(yán)重污染, 水稻糙米的鎘濃度高達(dá) 0.4～1.0 mg?kg-1; 江西省大余縣鎘污染農(nóng)田面積達(dá)5 500 hm2, 嚴(yán)重污染的面積占12%[3]; 上海的沙川灌區(qū)、廣東的廣州、韶關(guān)地區(qū)、廣西的陽(yáng)朔以及湖南的衡陽(yáng)等地均可能產(chǎn)生鎘米[4]。農(nóng)田鎘污染已嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食安全,如何控制農(nóng)田鎘污染已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的難題。植物、微生物等生物修復(fù)技術(shù)因具無二次污染、不破壞土壤環(huán)境、處理時(shí)間短、投資少、操作簡(jiǎn)單、適應(yīng)性廣、金屬選擇性高等特點(diǎn)倍受人們關(guān)注[5]。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種植物根際促生菌, 其根際集群能力強(qiáng)、世代時(shí)間短, 能分泌植物抗病及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等, 已被用作生防菌[6-7]。銅綠假單胞菌還具較強(qiáng)的重金屬耐性與富集能力, 可望用于重金屬污染環(huán)境的修復(fù), 因而備受人們關(guān)注[8-12]。Sinha等[8]從污水中分離出 1株銅綠假單胞菌, 其細(xì)胞內(nèi)鎘濃度高達(dá) 8 mmol?L-1, 經(jīng) Zn2+和Cd2+誘導(dǎo)的菌株Co2+耐性濃度達(dá)3 mmol?L-1[9], 而菌株產(chǎn)生的表面活性劑對(duì)Cu2+和 Zn2+的去除率分別達(dá) 63.7%、15.3%[10]; 銅綠假單胞菌經(jīng)聚合物固定制備的菌劑對(duì) Cu2+的最大吸附容量達(dá) 0.34 mmol?g-1(約 21.7 mg?g-1)[11]。可見,將具有較強(qiáng)重金屬耐性和富集能力的銅綠假單胞菌制成菌劑用于農(nóng)田重金屬污染修復(fù), 可為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持[12]?，F(xiàn)有可供選擇的菌劑載體種類繁多、性能各異, 以硅藻土和活性炭等載體具良好的吸附性能最為常見?；钚蕴坷w維對(duì)鎘離子的吸附率最高達(dá) 85%[13], 而硅藻土原土對(duì)重金屬離子 Pb(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)的去除率為 15.92%、3.92%[14], 已有用硅藻土做熒光假單胞菌P13菌劑的載體的研究報(bào)道[15]。但目前針對(duì)銅綠假單胞菌的研究仍然主要停留在研究其對(duì)重金屬的耐性與去除率上, 鮮見銅綠假單胞菌菌劑用于水稻鎘污染修復(fù)的研究報(bào)道。本課題組前期從水稻根際分離出 1株具有鎘富集作用的銅綠假單胞菌, 耐鎘濃度為 700 mg?L-1[16], 并對(duì)水稻生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用[17], 但有關(guān)該菌株及其菌劑對(duì)水稻生長(zhǎng)及鎘積累的研究尚少見報(bào)道。為此, 本文擬通過水培試驗(yàn), 考察菌株載體、菌液及其制備的菌劑對(duì)水稻生長(zhǎng)及鎘積累的影響, 為菌株應(yīng)用于水稻鎘污染修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試水稻為抗鎘水稻品種‘PI312777’[18], 菌株為前期從水稻根際分離出的銅綠假單胞菌。菌劑載體材料硅藻土購(gòu)買自上海秋草園藝設(shè)備有限公司, 硅藻土A的粒徑為1～3 mm, 硅藻土B的粒徑為 3～6 mm; 顆粒狀活性炭購(gòu)買自上海展云化工有限公司, 比表面積約為1 000 m2?g-1。

試驗(yàn)設(shè)置11個(gè)處理, 對(duì)比研究菌液、菌劑對(duì)水稻生長(zhǎng)及鎘吸收的影響: 1)無鎘無菌(CK); 2)Cd;3)Cd+菌液A; 4)Cd+菌液B; 5)Cd+菌液C; 6)Cd+硅藻土A; 7)Cd+硅藻土B; 8)Cd+活性炭; 9)Cd+菌劑A;10)Cd+菌劑B; 11)Cd+菌劑C。各處理3次重復(fù), 具體處理詳見表1。菌劑的制備方法參照文獻(xiàn)[12]。分別稱取等質(zhì)量的硅藻土A、硅藻土B和活性炭于燒杯中, 經(jīng) 121 ℃間歇式高壓滅菌 30 min 兩次后,65 ℃烘干后用于制備菌劑。在無菌條件下, 參照 3種載體材料的吸水率(硅藻土A、硅藻土B和活性炭依次為60.3%、43.3%和23.4%)加入銅綠假單胞菌菌液(以在37 ℃培養(yǎng)24 h的銅綠假單胞菌懸液計(jì), 濃度為3.21×107CFU?mL-1), 混勻并保持載體濕潤(rùn)、疏松、不結(jié)塊, 制成菌劑A、菌劑B和菌劑C, 用于后續(xù)試驗(yàn)。不同菌液活菌數(shù)為: 菌液A, 2.90×109CFU;菌液 B, 2.08×109CFU; 菌液 C, 1.13×109CFU。不同菌劑接種后的活菌數(shù)量大小為: 菌劑 A(2.90×109CFU)＞菌劑 B(2.08×109CFU)＞菌劑 C(1.13×109CFU)。水稻盆栽試驗(yàn)在玻璃溫室中進(jìn)行。將3葉期的水稻“PI312777”秧苗移栽至裝有10 L營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆(50 cm×40 cm×15 cm)中, 每盆 20株, 秧苗采用泡沫板分隔、海綿固定, 營(yíng)養(yǎng)液采用國(guó)際水稻研究所常規(guī)配方[19], pH 5.5左右, 每7 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。在水稻生長(zhǎng)至5葉期時(shí)進(jìn)行處理, 水培4周后, 取樣, 測(cè)定水稻的生長(zhǎng)狀況及各部位的鎘含量。

表1 水培試驗(yàn)各處理的鎘、載體、菌液及菌劑添加量Table 1 Amounts of Cd2+, bacteria suspensions, carriers and microbial inoculum in different treatments of hydroponic experiment

1.2 水稻生長(zhǎng)指標(biāo)及鎘含量測(cè)定

水稻水培 4周后, 采樣各處理水稻植株, 植株根部經(jīng) EDTA-Na2浸泡去除表面吸附的鎘后,用去離子水淋洗 3次, 以吸水紙吸干根部, 然后用直尺分別測(cè)量水稻株高、根長(zhǎng); 采集的植株按根、莖鞘和葉3個(gè)組分分別取樣。根、莖鞘和葉樣品經(jīng)105 ℃殺青1 h、72 ℃烘干后稱重, 生物量以干重表示。最后, 各樣品經(jīng)粉碎、過篩后用于鎘含量測(cè)定。各處理3次重復(fù)。

鎘含量測(cè)定采用原子吸收火焰光度計(jì)法。根、莖鞘和葉樣品采用微波消解, 經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后用于測(cè)定。水稻地上部及全株的鎘含量為相應(yīng)組分的加權(quán)平均值。遷移系數(shù)(transport factor,TF)=地上部鎘含量/根部鎘含量, 富集系數(shù)(biological concentration factor, BCF)=地上部鎘含量/營(yíng)養(yǎng)液鎘含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行, 采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較,P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液、菌劑對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響

由圖1A可見, 鎘脅迫處理顯著抑制了水稻根長(zhǎng)、株高的生長(zhǎng)和干物質(zhì)積累, 菌液及菌劑處理后促進(jìn)了水稻的生長(zhǎng)。鎘處理水稻根長(zhǎng)比對(duì)照(15.5 cm)顯著降低28.5%。除硅藻土B外, 其余各處理均對(duì)水稻的根長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。菌劑C處理的根長(zhǎng)比鎘處理增加了59.5%, 亦比CK高出 14.2%; 菌液 A、菌液 B、活性炭及菌劑 A處理的比鎘處理高出29.7%、50.5%、48.6%和41.4%,與 CK無顯著差異; 菌液 C、硅藻土 A、菌劑 B處理的依次比鎘處理高出23.4%、18.0%、18.0%,顯著低于CK(圖1A)。

鎘處理水稻株高(50.1 cm)比對(duì)照(80.3 cm)下降37.6%, 各處理亦顯著低于對(duì)照(圖1B)。經(jīng)菌液B、硅藻土A、硅藻土B處理后株高依次增加9.9%、11.8%、22.2%, 處理間差異不顯著; 菌液A、菌液C、活性炭及不同菌劑處理后株高增加32.7%～46.4%, 均顯著高于鎘處理(圖1B)。

鎘處理水稻單株生物量(0.52 g)比對(duì)照(0.80 g)下降35.0%(圖1C)。菌液C、硅藻土A、硅藻土B處理水稻生物量與鎘處理間無顯著差異, 其余處理的水稻生物量與對(duì)照無顯著差異, 但比鎘處理的高出 38.5%～67.3%, 以菌劑 B處理的生物量最高, 達(dá) 0.87 g(圖1C)。

圖1 不同菌液與菌劑處理對(duì)鎘脅迫下水稻的根長(zhǎng)(A)、株高(B)和生物量(C)的影響Fig. 1 Root length (A), plant height (B) and biomass (C) of rice treated with different bacterial agents under cadmium stress condition

2.2 菌液、菌劑對(duì)水稻鎘含量及其遷移能力的影響

由圖2A可見, 鎘含量在水稻不同部位間存在顯著差異, 鎘含量平均值從高到低為: 根(633.8 mg·kg-1)＞莖鞘(128.5 mg·kg-1)＞葉(33.0 mg·kg-1),地上部平均鎘含量為 71.8 mg·kg-1, 顯著低于根系(633.8 mg·kg-1)和全株(188 mg·kg-1)。菌劑及活性炭處理顯著降低了水稻根、莖鞘、葉的鎘含量,降低幅度依次為 17.2%～41.2%、1.4%～59.9%、31.1%～62.6%; 鎘鈍化能力大小為: 菌劑 C/活性炭＞菌劑 A/B＞菌液 A/B＞硅藻土 A/B; 菌劑 C處理水稻根、莖鞘、葉的鎘濃度最低, 分別為500.0 mg·kg-1、68.0 mg·kg-1、21.3 mg·kg-1, 依次比鎘處理降低41.2%、59.9%、62.6%; 菌劑A處理降低了35.6%、41.8%、58.9%; 菌劑B處理降低了33.5%、43.2%、59.0%。經(jīng)菌劑 A、菌劑 B、菌劑 C及活性炭處理后, 水稻地上部鎘含量依次比鎘處理(101.3 mg·kg-1)下降了45.9%、47.9%、59.9%和 59.9%。經(jīng)菌劑及活性炭處理后, 水稻全株鎘含量為 136.2～220.1 mg·kg-1, 顯著降低(圖2A)。

從鎘的遷移系數(shù)(TF)看, 不同處理的鎘TF為0.08～0.13。添加空載體硅藻土A、硅藻土B及菌液處理后TF無顯著變化, 添加活性炭、菌劑A、菌劑B、菌劑C處理后顯著降低了TF, 降低幅度依次為 33.3%、16.7%、25.0%和 33.3%(圖2B)。從富集系數(shù)(BCF)看, 各不同處理均顯著抑制了水稻的鎘富集作用, 活性炭和菌劑C處理的BCF分別為17.8和18.3, 比鎘處理(45.0)降低了60.9%和58.8% , 菌劑A、菌劑B處理的BCF分別為23.6和23.3, 降低了 48.1%%和48.8%(圖2C)。

2.3 菌液、菌劑對(duì)水稻鎘積累的影響

從鎘積累總量看, 菌液 A處理顯著提高了鎘積累量, 菌液 B、菌液 C、硅藻土 A、硅藻土 B及菌劑 B處理在一定程度上提高了鎘積累量, 但與鎘處理無顯著差異(圖3)。菌液A、菌液B、菌液C、硅藻土A、菌劑B處理后鎘積累量依次增加了30.4%、14.9%、16.9%、5.5%、2.0%、15.0%(圖3)?；钚蕴?、菌劑 C處理降低了單株水稻的鎘積累, 降低幅度分別為18.2%和24.3%, 菌劑C處理的鎘積累量最低(96.8 μg), 是鎘處理的 75.7%(圖3)。菌劑A處理的鎘積累量降低了9.5%, 但與鎘處理間無顯著差異。

從各器官鎘積累量看, 根是水稻最主要的積累部位, 不同處理水稻的根部鎘積累量存在一定的差異, 但與鎘處理(85.0 μg)間均無顯著差異(圖3); 經(jīng)菌液 A處理的莖鞘的鎘積累量顯著高于鎘處理(28.3 μg), 而活性炭、菌劑C處理的則顯著低于鎘處理; 經(jīng)不同菌劑、不同載體、菌液 B處理的水稻葉鎘積累量均顯著低于鎘處理(14.6 μg)。

從地上部鎘積累量所占的比例看, 菌液 A、菌液B、菌液C處理依次比鎘處理(42.9%)提高了11.0%, 0.9%、5.8%; 活性炭、菌劑A、菌劑B、菌劑C處理則分別降低了18.3%、6.1%、7.6%、19.8%。

3 討論與結(jié)論

鎘位列重金屬污染物“五毒”之首, 可通過遷移、富集對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[1-2,20]。鎘脅迫往往導(dǎo)致植物根系伸長(zhǎng)受抑、活力降低、根數(shù)減少, 影響植物的營(yíng)養(yǎng)吸收與生長(zhǎng), 最終降低了生物量[21]。本研究表明, 鎘脅迫下水稻的株高、根長(zhǎng)及干物質(zhì)積累均顯著下降, 這與前人的研究結(jié)論一致[18,22]。添加菌液及菌劑處理顯著促進(jìn)了鎘脅迫水稻的生長(zhǎng)和干物質(zhì)積累, 在一定程度上緩解了鎘脅迫, 這可能與銅綠假單胞菌具較強(qiáng)的重金屬耐性與富集能力, 可通過細(xì)胞表面吸附、絡(luò)合或胞內(nèi)外富集作用降低了鎘毒害有關(guān)[8-11,16]。此外, 銅綠假單胞菌還可通過次生代謝產(chǎn)生的等與 Cd2+形成難溶的沉淀[23], 通過分泌植物抗病與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)促進(jìn)生長(zhǎng), 表現(xiàn)出根際促生菌的作用[6-7]。

圖3 不同菌液與菌劑處理對(duì)鎘脅迫下水稻鎘積累量的影響Fig. 3 Cd accumulation of rice treated with different bacterial agents under cadmium stress condition

添加空載體也在一定程度上促進(jìn)了水稻生長(zhǎng)及其干物質(zhì)積累, 但不同載體間存在顯著差異?；钚蕴?、硅藻土空載體具有疏松多孔的結(jié)構(gòu), 本身具有一定的重金屬吸附能力, 但其比表面積不同, 吸附性能也不同[13-14,24-27]。天然的硅藻土比表面積一般在 19～65 m2·g-1[24], 活性炭的比表面積可高達(dá)1 000～3 000 m2·g-1[25], 具有極強(qiáng)吸附能力, 在本研究中表現(xiàn)出顯著的鎘鈍化吸收效應(yīng)。一些研究表明,活性炭對(duì)Pb2+的吸附率可達(dá)90%[26], 生物炭+石灰+硅藻土(BLD)配施處理后土壤有效態(tài)鎘可降低71.0%[27], 活性炭纖維對(duì)鎘離子的吸附率最高達(dá)85%[13], 而硅藻土原土對(duì)重金屬離子Pb(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)的去除率僅為 15.92%、3.92%[14], 因此活性炭比硅藻土具有更顯著的鎘鈍化效應(yīng)[13-14,24-27]。但硅藻土與菌液制備成菌劑后, 其對(duì)鎘脅迫的緩解效應(yīng)顯著大于硅藻土與菌液, 這種增效作用是否與硅藻土和菌株具有較好親和性, 促進(jìn)了生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的分泌或降低了鎘的有效性等有關(guān), 有待進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。但活性炭與菌液制備成菌劑后并未觀察到這種增效作用。

一般地, 鎘脅迫水稻各器官的鎘含量高低為:根＞莖鞘＞稻谷＞葉片[28], 這與本研究結(jié)果: 根＞莖鞘＞葉片相吻合。菌液、菌劑和空載體處理, 促進(jìn)了水稻生長(zhǎng), 同時(shí)顯著降低了各部位的鎘含量,一方面體現(xiàn)了生物量的稀釋效應(yīng), 另一方面可能通過影響水稻的鎘吸收與轉(zhuǎn)運(yùn), 降低鎘含量。硅藻土和菌液處理并不改變鎘在水稻體內(nèi)的遷移系數(shù), 活性炭和菌劑卻顯著降低了鎘的遷移, 這可能與活性炭對(duì)重金屬具有極強(qiáng)的吸附有關(guān)[13,26],也可能是銅綠假單胞菌對(duì)鎘的結(jié)合或通過影響水稻的次生代謝作用, 改變了鎘的形態(tài)和有效性,從而影響鎘的遷移[28]。硅藻土的吸附性能遠(yuǎn)低于活性炭, 但與銅綠假單胞菌復(fù)合后, 有效地抑制了鎘從水稻根部向上的遷移, 降低水稻體內(nèi)的鎘濃度, 對(duì)鎘脅迫起到一定的緩解作用[16], 這也證明了銅綠假單胞菌具有應(yīng)用于水稻鎘污染修復(fù)的潛力。

農(nóng)業(yè)環(huán)境重金屬污染的治理方法多種多樣,物理、化學(xué)及生物修復(fù)技術(shù)各具優(yōu)勢(shì)[29]?；钚蕴烤哂袃?yōu)異的吸附性能, 在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛用作脫色劑、吸附劑, 也用于水處理等高附加值的工藝,效果極佳, 但成本高昂[30]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 應(yīng)用活性炭去除環(huán)境中的重金屬, 投入產(chǎn)出比差, 推廣應(yīng)用難度大[31]。硅藻土的吸附性能雖然不如活性炭, 但環(huán)境友好、價(jià)格低廉, 已被廣泛用作環(huán)境治理的材料[32], 與銅綠假單胞菌結(jié)合, 制成菌劑后, 對(duì)水稻生長(zhǎng)既有一定的促進(jìn)作用, 又可有效降低水稻體內(nèi)的鎘含量, 制備的菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用前景[12]。

鎘脅迫下, 添加銅綠假單胞菌菌液及菌劑處理顯著促進(jìn)了水稻的生長(zhǎng)與干物質(zhì)積累, 降低了水稻各部位的鎘含量與富集量。添加菌劑處理顯著降低了鎘在水稻體內(nèi)的遷移系數(shù)。銅綠假單胞菌既是一種促生菌, 又可降低水稻對(duì)鎘的吸收，具有鎘污染環(huán)境修復(fù)的應(yīng)用前景。

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