張 凱，李凡飛，何小麗，王文佳，程 成，張 超，許立華

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

衣原體(Chlamydia)屬于專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，菌體大小0.2 μm～1.0 μm，全基因組大小為1.1 Mbp左右，是一類人獸共患傳染病病原。動物感染衣原體后，主要引起患病動物生殖器官、關(guān)節(jié)、結(jié)膜、肺臟和腸道等部位發(fā)生持續(xù)感染、反復(fù)感染或隱性感染[1]。衣原體具有獨特的雙相型發(fā)育周期，一種是具有感染性，存在于細(xì)胞外非繁殖型的原體(EB)，另一種是不具有感染性，存在于細(xì)胞內(nèi)繁殖型的始體(RB)。EB與RB的轉(zhuǎn)化過程就是衣原體感染增殖的過程。截至目前，衣原體屬包含11個種，即鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)、沙眼衣原體(C.trachomatis)、貓衣原體(C.felis)、豬衣原體(C.suis)、流產(chǎn)衣原體(C.adortus)、鼠衣原體(C.muridarum)、肺炎衣原體(C.pueumoniae)、豚鼠衣原體(C.caviae)、反芻動物衣原體(C.pecorum)，以及鳥衣原體(C.avium)和家禽衣原體(C.galinacea)[2]。

作為一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核微生物，衣原體進入真核細(xì)胞后利用宿主細(xì)胞營養(yǎng)，加之其具有雙相發(fā)育周期，增殖在RB包涵體中，不僅能夠躲避宿主細(xì)胞的免疫防御機制，還能避免被溶酶體消化，在細(xì)胞內(nèi)的繁殖發(fā)育可以受到一定的保護。到目前為止，衣原體的致病機制尚不清楚，研究者正通過研究衣原體毒力因子與宿主細(xì)胞的相互作用來了解衣原體致病過程。從目前的研究發(fā)現(xiàn)，主要外膜蛋白(MOMP)、多形態(tài)膜蛋白(Pmps)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)、脂多糖(LPS)、熱休克蛋白(HSP)、質(zhì)粒及蛋白酶樣活性因子(CPAF)在衣原體致病過程中起重要作用。

1 主要外膜蛋白

衣原體主要外膜蛋白(MOMP)占膜蛋白總量的60%以上，分子量約為40 ku。MOMP由ompA結(jié)構(gòu)基因編碼，當(dāng)前衣原體的基因分型主要是用ompA基因當(dāng)作靶基因來構(gòu)建[3]。MOMP由暴露在表面的4個親水可變區(qū)(VD1-VD4)和5個內(nèi)部疏水保守區(qū)(CD1-CD5)組成，可變區(qū)位于保守區(qū)之間。其中VD1和VD2有豐富的T細(xì)胞表位，而VD4含有豐富的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在EB期，MOMP 4個可變親水結(jié)構(gòu)域VD暴露于衣原體外膜表面，黏附于易感細(xì)胞的甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長因子受體2(M6PR/IGFR2)發(fā)揮黏附和侵襲作用。在RB繁殖期間，MOMP主要執(zhí)行孔蛋白的功能，為衣原體的發(fā)育提供必要的物質(zhì)轉(zhuǎn)運[5]。由此可見，MOMP對于衣原體整個生命周期中的新陳代謝和感染性起著重要作用。

2 多形態(tài)膜蛋白

對于衣原體這種胞內(nèi)寄生菌，感染宿主細(xì)胞最重要的步驟之一是黏附蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用。目前已經(jīng)鑒定了衣原體的幾種黏附蛋白，包括MOMP、HSP、外膜復(fù)合物B(OmcB)和多態(tài)性膜蛋白(Pmps)。Pmps是衣原體特有的一類膜結(jié)合蛋白，之前被稱為90 ku蛋白族。Pmps在鸚鵡熱衣原體中首先被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)衣原體屬的其他成員也存在Pmps。Pmps含有多種基因簇，例如：沙眼衣原體含有9種Pmps基因，其編碼的蛋白包括(PmpA-pmpI)9種蛋白。而肺炎衣原體和流產(chǎn)衣原體分別有21種和18種Pmps基因[6]。衣原體在感染循環(huán)期間或應(yīng)激反應(yīng)中Pmps基因的表達有所不同。許多研究表明，Pmps可作為自動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，因其含有3個功能域，包括可在膜表面易位的GG(A、I、L、V、Y)和FXXN四肽型N末端結(jié)構(gòu)域、用于表面定位或分泌的結(jié)構(gòu)域和C末端β桶型外膜轉(zhuǎn)位定位結(jié)構(gòu)域[7]。有研究表明，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Pmps能夠誘導(dǎo)感染細(xì)胞中的先天免疫反應(yīng)，包括產(chǎn)生IL-8、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)等[8]。在沙眼衣原體中，PmpB、PmpC、PmpD和PmpI是引起炎癥性疾病中最強免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。綜上所述，Pmps作為具有自動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的黏附蛋白，不僅與MOMP一樣對衣原體的新陳代謝和感染性相關(guān)，而且可以使宿主細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。

3 Ⅲ型分泌系統(tǒng)

目前研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌含有6種入侵宿主細(xì)胞的特異性分泌系統(tǒng)(Ⅰ-Ⅵ型)。其中最關(guān)鍵的便是細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。不像其他病原體的T3SS是由組合在一起的毒力島編碼，衣原體科的成員擁有至少13個分布在整個染色體上的基因與其T3SS相關(guān)，并且與鞭毛系統(tǒng)具有很高同源性[9]。T3SS呈“注射器狀”存在于衣原體膜上，整個裝置橫跨衣原體膜內(nèi)外，注射裝置伸向宿主細(xì)胞。其主要由裝置蛋白、效應(yīng)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、分子伴侶四部分構(gòu)成。在沙眼衣原體中，5種蛋白質(zhì)與衣原體T3SS結(jié)構(gòu)相關(guān)：CT671是針頭分子尺，CT860和CT579易位元件，CT665和CT667為分子伴侶調(diào)節(jié)針頭聚合[10]。T3SS的致病作用主要是通過向宿主細(xì)胞釋放其效應(yīng)蛋白(T3SE)來實現(xiàn)。在衣原體中，易位性復(fù)原活動磷酸化蛋白(TarP)、外膜蛋白CopN和包涵體膜蛋白(Incs)等是主要的T3SE，它們在早期被遞送到宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用[11]。在衣原體感染過程中，T3SS定植在宿主細(xì)胞的質(zhì)膜上并將T3SE直接通過其注射器狀結(jié)構(gòu)注射到宿主細(xì)胞胞質(zhì)，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)并干擾免疫信號傳導(dǎo)，從而影響正常細(xì)胞器功能及免疫應(yīng)答，導(dǎo)致宿主細(xì)胞新陳代謝和免疫反應(yīng)紊亂。

4 脂多糖

像大多數(shù)革蘭陰性菌一樣，衣原體外膜最外層還存在著一種脂多糖(LPS)。LPS是革蘭陰性菌致病的關(guān)鍵因子，可激活多種炎癥細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)引起炎癥反應(yīng)，還能導(dǎo)致機體微循環(huán)功能紊亂，造成機體器官損傷和休克等病癥的發(fā)生。衣原體脂多糖(cLPS)由一個3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖乙酸脂(KDO)的核心與脂質(zhì)A連接而成。cLPS對衣原體EB期的感染性起關(guān)鍵作用。cLPS缺失，EB無感染性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，感染期間cLPS從受染細(xì)胞中釋放。cLPS結(jié)合可溶性CD14受體(sCD14)與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合形成cLPS復(fù)合物[13]。cLPS復(fù)合物通過細(xì)胞膜結(jié)合的mCD14激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1和IL-6，這些細(xì)胞因子導(dǎo)致合成應(yīng)激反應(yīng)物。作為革蘭陰性菌致病關(guān)鍵因子，cLPS通過對衣原體感染性起作用并通過刺激產(chǎn)生炎癥因子和應(yīng)激反應(yīng)物，對機體造成病理損傷。

5 熱休克蛋白

衣原體感染主要是由于慢性炎癥造成組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)衣原體熱休克蛋白HSP60(GroEL或GroEL1)、HSP10(GroES)和HSP70(DnaK)與這種有害的宿主免疫應(yīng)答相關(guān)。在衣原體發(fā)育周期中，衣原體熱休克基因受感染細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子HrcA的調(diào)控[14]。肺炎衣原體的HSP60在EB表面上表達，作為主要的黏附蛋白，在肺炎衣原體相關(guān)疾病的發(fā)病機理中起重要作用。在炎癥期間，HSP60可能引發(fā)血管細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌[15]。肺炎衣原體HSP60不但與冠狀動脈疾病患者動脈粥樣硬化斑塊中的凋亡信號通路有關(guān)，而且其通過降低血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能來抑制新血管形成[16]。Kang Y等[17]將肺炎衣原體HSP60注入正常小鼠與MAPK激酶3(MKK3)敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)MKK3敲除小鼠的肺部中性粒細(xì)胞和促炎介質(zhì)減少，證實了MKK3在HSP60誘導(dǎo)的肺部炎癥起到的關(guān)鍵作用。作為衣原體的保護性蛋白，HSP通過黏附、介導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，使機體誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

6 質(zhì)粒

在沙眼衣原體、鼠衣原體和鸚鵡熱衣原體中都含有一個隱蔽質(zhì)粒，衣原體質(zhì)粒是一個分子質(zhì)量約為7.5 kb、基因序列高度保守的非整合DNA分子。衣原體質(zhì)粒有8個開放閱讀框，分別編碼8種不同的糖蛋白(pGP1-pGP8)。其中，pGP3分子質(zhì)量約為28 ku，可能直接被分泌到宿主細(xì)胞胞質(zhì)，引起宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。pGP4和pGP5可以調(diào)節(jié)衣原體染色體基因的表達，而其他則為衣原體質(zhì)粒維持自身功能的蛋白[18]。研究發(fā)現(xiàn)，pGP3由可以結(jié)合并中和由上皮細(xì)胞和白細(xì)胞分泌的抗菌肽LL-37，參與免疫逃避[19]。pGP3可通過激活NALP3炎性體和p38/MAPK途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β和IL-18[20]。Zhou H等[21]研究發(fā)現(xiàn)，沙眼衣原體pGP3還可通過THP-1細(xì)胞中的TLR2活化誘導(dǎo)MAPK介導(dǎo)產(chǎn)生與輸卵管積水有關(guān)的促炎細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒缺失的鼠衣原體相比鼠衣原體正常株從生殖道傳播到消化道的數(shù)量大大減少[22]。證實了質(zhì)粒對于鼠衣原體定植在消化道起到重要作用。由此可見，衣原體質(zhì)粒不僅參與免疫逃避，還與消化道的定植及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

7 蛋白酶樣活性因子

衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)是分泌到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中保守的絲氨酸蛋白酶，在免疫逃避中起重要作用。功能性的CPAF是由N末端35 ku(CPAFn)和C末端29 ku(CPAFc)的亞基組成的二聚體結(jié)構(gòu)蛋白，分子質(zhì)量約70 ku。CPAF通過T2SS介導(dǎo)分泌進入宿主細(xì)胞胞質(zhì)[23]。CPAF不僅能降解轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65和自適應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子USF-1和RFX5蛋白，還能維持病原體囊泡完整性。RFX5為MHCⅠ區(qū)和β2微球蛋白啟動子激活物，而USF-1可以激活I(lǐng)FN-γ誘導(dǎo)的MHCⅡ區(qū)基因的表達，USF-1和RFX5被CPAF降解使MHC分子的表達受到限制，使抗原的呈遞受限，阻礙了機體免疫系統(tǒng)對衣原體的識別而引起的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫逃逸的形成[24]。另外，CPAF還可降解由上皮細(xì)胞表達的糖蛋白CD1d，引起細(xì)胞表面CD1d降低，阻礙其通過NK和NKT細(xì)胞發(fā)生先天免疫應(yīng)答，從而有利于衣原體的免疫逃避和持續(xù)性感染[25]。研究發(fā)現(xiàn)，沙眼衣原體CPAF缺乏株不能夠在小鼠生殖道存活，而沙眼衣原體含CPAF野生株卻可以在小鼠生殖道存活3周以上[26]。證實了CPAF促進沙眼衣原體在小鼠生殖道中存活。采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析沙眼衣原體CPAF缺乏株和正常含CPAF野生株感染人上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CPAF和T3SE合作抑制宿主先天免疫[27]。其機理為CPAF與T3SE合作阻斷NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致IFN-β和促炎細(xì)胞因子合成減少。因此，CPAF不僅對衣原體的免疫逃避至關(guān)重要，而且衣原體的定植和持續(xù)性感染起到一定的作用。

8 討論

衣原體這種獨特的病原體利用其毒力因子來建立細(xì)胞內(nèi)的生存環(huán)境并干擾宿主的免疫應(yīng)答。因此，了解衣原體如何黏附進入細(xì)胞、如何在細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中生存，就能夠揭示其對宿主的致病作用。雖然有很多的研究者都在研究衣原體的致病機理，但是擺在人們面前的任務(wù)還很艱巨。由于衣原體種類繁多且具有宿主特異性，而且其毒力因子在激活機體的免疫機制過程中的相互作用并沒有研究清楚。因此，要搞清楚衣原體的致病機理，還需要用進一步的試驗和數(shù)據(jù)來驗證。我國自1956年病毒學(xué)家湯飛凡采用雞胚卵黃囊接種法在世界上首次分離到沙眼衣原體后，越來越多的研究者便開始了衣原體的研究。目前，我國已在衣原體疫苗、檢測方法等領(lǐng)域取得一些成果[28]。隨著功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳組學(xué)和基因編輯等新技術(shù)的發(fā)展，為我們在研究衣原體致病機理上提供了新的思路和方法。利用毒力基因敲除和功能基因組學(xué)等方法將幫助我們解決某些T3SE以及其他毒力因子的功能問題。加之細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和動物模型的改進，將為了解衣原體這一具有獨特發(fā)育周期的專性細(xì)胞內(nèi)寄生病原體提供更好的條件。

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