譚 超，肖紅波

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128)

柚皮苷是從蕓香科植物柚果實中分離的黃酮類化合物，有報道柚皮苷能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[1-5]，但其機理未明。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)/低密度脂蛋白受體(LDLR)通路已經(jīng)成為高膽固醇血癥治療的新靶點[6-10]，所以，本試驗研究柚皮苷是否可通過調(diào)節(jié)PCSK9- LDLR通路防治試驗性大鼠的高脂血癥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 柚皮苷，純度98%，上海永家生物科技有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒，上海恪敏生物科技有限公司產(chǎn)品；甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白膽固醇( LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，上海信帆生物科技有限公司產(chǎn)品；膽酸鈉和膽固醇，國藥集團試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 健康雌性SD大鼠60只，雌雄各半，體重200 g～220 g，基礎飼料和高脂飼料(1%膽固醇、8%豬油、0.25%膽酸鈉和90.75%的基礎飼料)由湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院小動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 動物試驗分組：基礎飼料適應喂食1周后，大鼠隨機分成6組(n=10)，即正常對照組、高脂模型組、低劑量預防組、高劑量預防組、低劑量治療組和高劑量治療組。正常對照組喂食基礎飼料，其余各組喂食高脂飼料，自由進食飲水。低、高劑量預防組每天需同時灌喂低劑量(10 mg/kg)、高劑量(30 mg/kg)柚皮苷。低、高劑量治療組需在喂食高脂飼料1周后開始灌喂柚皮苷。5周后，頸總動脈取血分離血清測定血脂。處死大鼠，摘取肝臟分析PCSK9和LDLR的表達。

1.2.2 檢測指標和方法 肝PCSK9和LDLR mRNA表達采用熒光定量PCR檢測(PCSK9:forward,5′-TTGCAGCAGCTGGGAACTT-3′,reverse,5′-CCGACTGTGATGACCTCTGGA-3′; LDLR:forward,5′-AGGCTGTGGGCTCCATAGG-3′,reverse,5′-TGCGGTCCAGGGTCATCT-3′; 36B4:forward,5′-GCGACCTGGAAGTCCAACTAC-3′,reverse:5′-ATCTGCTGCATCTGCTTGG-3′)[3]；血脂(TC、TG、LDL-C和HDL-C)水平采用試劑盒(北京中生北控生物科技股份公司)和全自動生化分析儀(日本日立7170型)檢測。

1.2.3 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS22.0進行分析。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對大鼠肝PCSK9和LDLR mRNA表達的影響

高脂能顯著增加大鼠肝PCSK9表達水平，降低LDLR表達(P<0.01)。試驗結(jié)束時，4個柚皮苷處理組大鼠肝PCSK9表達水平都顯著低于高脂模型組，與此同時，4個柚皮苷處理組中LDLR表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)(圖1)。

2.2 柚皮苷對大鼠血脂的影響

高脂模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C都顯著高于正常對照組，HDL-C顯著低于正常對照組(P<0.01)，表明實驗性大鼠高脂模型建立成功。4個柚皮苷處理組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平都顯著低于高脂模型組，4個柚皮苷處理組中HDL-C的水平較高脂模型組有明顯升高(P<0.05或P<0.01)(表1、表2)。

A.PCSK9表達；B.LDLR表達。與對正常對照組相比，**P<0.01; 與高脂模型組相比*P<0.05,**P<0.01;1.正常對照組; 2.高脂模型組; 3.低劑預防組; 4.高劑預防組; 5.低劑治療組; 6.高劑治療組

A.PCSK9 expression; B.LDLR expression.Compared with control group,**P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;1.Control group; 2.High lipid group; 3.Low dose preventive group; 4.High dose preventive group; 5.Low dose treated group; 6.High dose treated group

圖1 肝前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)和低密度脂蛋白受體mRNA表達

注：與正常對照組相比++P<0.01；與高脂模型組相比*P<0.05,**P<0.05

Note:Compared with control group,++P<0.01；：Compared with high lipid group,*P<0.05,**P<0.05

表2 柚皮苷對大鼠血脂中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響

注：與正常對照組相比++P<0.01；與高脂模型組相比*P<0.05,**P<0.05

Note:Compared with control group,++P<0.01；：Compared with high lipid group,*P<0.05,**P<0.05

3 討論

PCSK9也稱為神經(jīng)細胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1或原蛋白轉(zhuǎn)化酶9，是枯草桿菌蛋白酶相關的絲氨酸蛋白酶家族的成員。PCSK9基因突變已與一個常染色體顯性遺傳的家族性高TC血癥和低TC血癥相鏈接。自然發(fā)生的PCSK9基因各種功能增益突變和功能損失突變，已經(jīng)分別被確定與高TC血癥和低TC血癥有關。這些的變異可通過提升其蛋白酶活性，減少LDLR水平從而阻礙TC攝取到細胞引起疾??；PCSK9的幾個變種也被可認為可導致循環(huán)中TC水平的 顯著降低[9-10]。

血漿LDL-C升高是心血管疾病的重要危險因素。血漿LDL-C水平可通過結(jié)合到LDLR吸收進細胞來控制。PCSK9的主要生理功能之一是介導LDLR的降解，控制LDLC顆粒在血液中循環(huán)的水平。當PCSK9結(jié)合LDLR的表皮生長因子樣重復結(jié)構(gòu)A時，可刺激LDLR的降解。LDLR水平的降低會導致LDLC代謝的減弱，這可能會導致高TC血癥和血漿LDLC水平的升高。本試驗的結(jié)果表明高脂血癥大鼠PCSK9的表達和血漿TG和TC水平顯著升高，LDLR的表達和血漿HDL-C水平顯著降低。因此，PCSK9-LDLR已經(jīng)成為新的調(diào)節(jié)血脂藥物作用通路[11-12]。

柚皮苷天然存在于柑橘類水果中，尤其是在葡萄柚中，它與這些水果的苦味有關[1]。本試驗證實了以前的結(jié)果即柚皮苷能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[1]。本試驗還發(fā)現(xiàn)柚皮苷能降低大鼠肝PCSK9表達水平，增加LDLR表達，表明柚皮苷能調(diào)節(jié)PCSK9-LDLR改善脂代謝紊亂，防治實驗性大鼠的高脂血癥。

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