夏良友，李士洋，王 雙，李宇琛，李龍飛，楊海峰，卜仕金

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

烯丙孕素(altrenogest)又名四烯雌酮，是一種人工合成的甾類促孕激素，屬于19-去甲睪酮類化合物[1]。烯丙孕素是一種口服有活性的孕激素，其藥理活性已在多種動物模型中得到了證實(shí)。類似于其他的類固醇，烯丙孕素可憑借其脂溶性穿透靶細(xì)胞，與特定受體結(jié)合[2]。烯丙孕素通過降低內(nèi)源促性腺激素(LH和FSH)的血漿濃度而起作用。低促性腺激素濃度誘導(dǎo)大卵泡(> 5 mm)消退，并且使卵泡生長無法大于3 mm，使得動物在給藥期間不會無法發(fā)情和排卵。給藥結(jié)束之后，LH血漿濃度增加，使得卵泡能夠生長和成熟[3-5]。之后，動物同步開始發(fā)情周期。在獸醫(yī)臨床烯丙孕素已被歐盟和美國批準(zhǔn)用于母豬和母馬的同步發(fā)情。本試驗(yàn)在國內(nèi)外現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上建立優(yōu)化了一種測定豬血漿中烯丙孕素的超高液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法，為烯丙孕素口服液制劑在豬體內(nèi)的藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 烯丙孕素對照品，批號160415，純度為99.2%，由寧波第二激素廠提供；睪酮對照品，純度為99.5%，由寧波第二激素廠提供；甲酸銨，色譜級，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；乙腈，色譜純，美國天地有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試液的配制 烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，即配成濃度為1 mg/mL烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置于-20℃下保存?zhèn)溆?，有效?個月。

烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 μg/mL)：準(zhǔn)確吸取適量烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用流動相(5 mmol/L甲酸銨水溶液∶乙腈=60∶40)稀釋成1 μg/mL烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液即可?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)物睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取睪酮標(biāo)約準(zhǔn)品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，即配成濃度為1 mg/mL睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置于-20℃下保存?zhèn)溆?，有效?個月。

內(nèi)標(biāo)物睪酮標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)：用100 μL移液器準(zhǔn)確吸取適量睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液用流動相(5 mmol/L甲酸銨水溶液∶乙腈=60∶40)稀釋成100 ng/mL睪酮工作液即可?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

甲酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取甲酸銨0.315 g至1 000 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，混勻后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，超聲處理脫氣即成。流動相現(xiàn)配先用。

1.1.3 主要儀器 AB SCIEX 三重四級5500系統(tǒng)：含串聯(lián)(TQ)四級桿Mass檢測器和Analyst軟件,AB SCIEX公司產(chǎn)品；超高效液相色譜儀Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜，Waters公司產(chǎn)品；色譜柱Inertsil C4(3.0×150 mm，5 μm)，購自揚(yáng)州華明儀器設(shè)備有限公司；Pacific RO 純水儀,購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；超生波清洗器,德國Elma Elmasonic P 專業(yè)級產(chǎn)品；Organomation Nitrogen Evaporator 氮吹儀,美國Organomation公司產(chǎn)品；Genius23010、ABN2ZA氮?dú)獍l(fā)生器,英國Peak Scientific公司產(chǎn)品；Eppendorf 5810R Centrifuge 高速冷凍離心機(jī),購自上海肯強(qiáng)儀器有限公司；SI可調(diào)速漩渦混合器 VORTEX-GENIE2,上海思伯明儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電子分析天平,感量0.000 1 g，德國賽多利斯天平公司產(chǎn)品；可調(diào)微量移液器,20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；指形管(10 mL、2 mL),揚(yáng)子化工玻璃儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 測定步驟

1.2.1.1 試料的制備 取新鮮或解凍的供試樣品,作為供試試料；取新鮮或解凍的空白樣品,作為空白試料；取新鮮或解凍的空白樣品,添加適宜濃度的對照溶液，作為空白添加試料。

1.2.1.2 樣品預(yù)處理 準(zhǔn)確吸取0.5 mL新鮮或凍融的血漿樣品于10 mL刻度離心管中渦旋2 min混勻后靜置10 min，加入2 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min。上清液移至10 mL刻度離心管中，40℃氮吹至干。殘?jiān)?.5 mL流動相(初始比例)溶解，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液轉(zhuǎn)移至高效液相色譜系統(tǒng)的自動進(jìn)樣器中供UPLC分析。全程避光操作。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取適量烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，依次用流動相(初始比例)稀釋成1 000、750、500、250、100 、50、25、10 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取空白血漿450 μL加入10 mL離心管中，再分別依次加入50 μL上述系列工作液，另用100 μL移液器精密量取100 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液25 μL分別置于上述離心管內(nèi)。分別制得100、75、50、25、10、5、2.5、1 ng/mL烯丙孕素空白血漿系列添加濃度?？瞻籽獫{添加樣品混勻后按1.2.1.2項(xiàng)下所述方法處理后，取上清液于2 mL自動進(jìn)樣瓶中供UPLC分析。不同時(shí)間重復(fù)考察5批烯丙孕素空白血漿系列添加濃度，共制備5個平行標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所得烯丙孕素和內(nèi)標(biāo)(睪酮)的峰面積比(area ratio)為縱坐標(biāo)，濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)作線性回歸，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.4 檢測限與定量限 制備5個平行空白血漿，按照1.2.1.2項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理后，上機(jī)測得平均基線噪音值。取信噪比S/N≥3時(shí)樣品的最低濃度為檢測限(LOD)，以信噪比達(dá)到S/N≥10時(shí)樣品的最低濃度為最低定量限(LOQ)。

1.2.1.5 準(zhǔn)確度和精密度 將一定濃度的烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液各50 μL加至450 μL空白血漿中，分別制得1、50、100 ng/mL 3個濃度的烯丙孕素空白血漿添加樣品，另用100 μL移液器精密量取100 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液25 μL分別置于上述離心管內(nèi)?；靹蚝蟀础?.2.1.2”項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理方法處理后，濾液供UPLC分析，確定其峰面積。每個濃度水平設(shè)6個平行(日內(nèi))，共重復(fù)考察3批(日間)，據(jù)此分別計(jì)算出日內(nèi)和日間變異系數(shù)。

1.2.1.6 測定

①色譜條件 色譜柱：Inertsil C4(3.0×150 mm，5 μm)；流速0.4 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A為5 mmol/L甲酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)? min～4 min為A∶B=60∶40，4 min～8 min為A∶B=10∶90，8.1 min～10 min為A∶B=60∶40，流速為0.4 mL/min。

②質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；檢測器：串聯(lián)(TQ)四級桿Mass檢測器；去簇電壓：126.8 U/V；噴霧電壓：5500.0 V；氣簾氣壓力：20.0 Psi；碰撞室壓力：8 Psi；離子化(離子源)溫度：550.0℃。烯丙孕素的定量離子對為311.1>227.2，輔助定性離子對為311.1>199.1；睪酮的定量離子對為289.2>109.1。

③定量測定 將血漿樣品按“1.2.1.2”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理后，再按“1.2.1.6”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行UPLC分析，測出待測物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算，并代入當(dāng)天隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出血漿中烯丙孕素的含量。

1.2.1.7 空白試驗(yàn) 除不加試料外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。

1.2.2 檢測方法的性能測試

1.2.2.1 專屬性或特異性 通過分析6份不同來源的豬空白血漿樣品考察內(nèi)源性干擾對方法專屬性的影響。對來自6份不同來源的豬空白血漿樣品，烯丙孕素和IS保留時(shí)間上應(yīng)不存在任何內(nèi)源性雜質(zhì)的顯著干擾。如存在干擾，則通過對3份加標(biāo)水平為LOQ的血漿樣品按照前述樣品預(yù)處理方法進(jìn)行提取，確定烯丙孕素在LLOQ水平及內(nèi)標(biāo)物(IS)在相應(yīng)濃度時(shí)的參考峰面積，應(yīng)用下列公式測定干擾程度(%)：

干擾(%)=A(空白)/A(LLOQ)×100%

對于烯丙孕素，如存在干擾，干擾峰面積應(yīng)低于LLOQ水平峰面積的20%；對于內(nèi)標(biāo)，如存在干擾，干擾峰面積應(yīng)低于IS峰面積的10%。

1.2.2.2 記憶效應(yīng)(殘留效應(yīng)) 精密吸取500 μL豬空白血漿，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法處理后制得空白基質(zhì)樣品，共制備4份空白基質(zhì)樣品。在同一次運(yùn)行期間，在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)(100 ng/mL)后進(jìn)行空白樣品進(jìn)樣測定。在同一次分析運(yùn)行內(nèi)使用3個LOQ平行質(zhì)控樣品進(jìn)樣，測定烯丙孕素在LOQ以及IS在相應(yīng)濃度時(shí)的參考峰面積。用空白基質(zhì)樣品分析物的殘留峰與最低定量下限(1 ng/mL)分析物峰面積比，考察LC-MS/MS系統(tǒng)的記憶效應(yīng)。

1.2.2.3 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)是指在樣品測試過程中，由待測物以外的其他物質(zhì)的存在，直接或間接影響待測物響應(yīng)的現(xiàn)象[6-7]，基質(zhì)效應(yīng)分為絕對基質(zhì)效應(yīng)和相對基質(zhì)效應(yīng)[8-10]。

絕對基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)：制備2組待測樣品。①將烯丙孕素和睪酮溶于乙腈溶液，并稀釋成相對應(yīng)的濃度；②提取空白血漿基質(zhì)，用流動相甲酸銨溶液∶乙腈(60∶40)稀釋烯丙孕素和睪酮，加入復(fù)溶的空白基質(zhì)中。將①和②放入系統(tǒng)進(jìn)行分析，得到烯丙孕素和睪酮的峰面積，其中烯丙孕素或睪酮在②和①中峰面積的比值為絕對基質(zhì)效應(yīng)，用基質(zhì)效應(yīng)因子(matrix factor，MF)來表示，烯丙孕素與睪酮MF的比值稱為內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子(IS-normalized MF)。

相對基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)：相對基質(zhì)效應(yīng)大小可以用 IS-normalized MF 的變異系數(shù)(CV)來判斷。選擇6個不同來源的豬空白血漿，測得烯丙孕素和睪酮的MF，(待測物濃度通常選擇一個低濃度即可，其濃度應(yīng)在3×LOQ以內(nèi))，并計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子，利用獲得的6個內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子計(jì)算變異系數(shù)，其值應(yīng)小于15%。

1.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2.3.1 儲備液穩(wěn)定性 將制備烯丙孕素和內(nèi)標(biāo)儲備液于-20℃下凍存放置6個月，期間分別于0、1、3和6個月時(shí)按照“1.2.1.6”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，以考察儲備液凍存期間穩(wěn)定性。分別制備添加濃度為1、50、100 ng/mL的3個空白添加樣品，每個濃度制備6個平行樣品。分別進(jìn)行儲備液凍存(在-20℃放置6個月)、預(yù)處理樣品(制備后的待測濾液)放置自動進(jìn)樣器內(nèi)(4℃放置約8 h)、樣品長期冷存(在-20℃放置3個月)和反復(fù)凍融(反復(fù)凍融處理3次)條件下的穩(wěn)定性考察。當(dāng)同一濃度水平至少5個穩(wěn)定性樣品測定值與真實(shí)值的相對誤差百分率在±15%范圍內(nèi)時(shí)，則表明相關(guān)樣品在相應(yīng)條件下放置可穩(wěn)定保存。

1.2.3.2 樣品凍存穩(wěn)定性 分別制備濃度為1、50、100 ng/mL的3個空白血漿添加樣品，每個濃度3個平行，在-20℃放置3個月，分別于0和3個月時(shí)按照“1.2.1.2”方法處理，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行測定。

1.2.3.3 樣品凍融穩(wěn)定性 分別制備濃度為1、50、100 ng/mL的3個空白血漿添加樣品，每個濃度3個平行，在-20℃反復(fù)凍融3次。每次按照“1.2.1.2”方法處理，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行測定。

1.2.3.4 樣品室內(nèi)短期放置穩(wěn)定性 分別制備濃度為1、50、100 ng/mL的3個空白血漿添加樣品，每個濃度制備6個平行樣品。按“1.2.1.2”項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理方法處理后，將濾液移至自動進(jìn)樣瓶后放置自動進(jìn)樣器內(nèi)(4℃)約8 h，分別于0 h、8 h時(shí)按照“1.2.1.6”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，以考察提取液樣品室內(nèi)短期放置穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，烯丙孕素在1 ng/mL～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999以上。

2.2 檢測限與定量限

在0.5 ng/mL濃度添加水平時(shí)，烯丙孕素的定性和定量離子的信噪比是5.1，大于3，且相對離子豐度符合要求；在1 ng/mL濃度添加水平時(shí)，烯丙孕素的定性和定量離子的信噪比是16.8，大于10，且相對離子豐度符合要求。因此本方法的檢測限和定量限可分別確定為0.5 ng/mL和1 ng/mL。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果見表1和表2。結(jié)果表明，烯丙孕素在低(1 ng/mL)、中(50 ng/mL)及高(100 ng/mL)下的批內(nèi)平均回收率均大于80%，變異系數(shù)均小于15%。批間平均回收率均大于85%，變異系數(shù)均小于9%。

2.4 檢測方法的性能測試

2.4.1 檢測方法的特異性 通過考察至少來自6只不同豬的空白血漿的測定結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品中待測物的測定，空白血漿、空白血漿添加烯丙孕素和IS(睪酮)的典型色譜圖見圖2～圖7。在本試驗(yàn)建立的色譜檢測條件下，烯丙孕素和內(nèi)標(biāo)物均能與血漿中其他基質(zhì)組分完全分開，且峰形良好。內(nèi)標(biāo)物(睪酮)和烯丙孕素的出峰時(shí)間分別約為4.38 min和4.77 min。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

添加濃度/(ng·mL-1)Added concentration回收率/% Recovery rate123456x±SD196.696.989.590.096.688.993.1±3.985085.295.889.688.8100.496.692.7±5.7510088.984.291.091.784.692.888.9±3.69

表2 血漿樣品精密度測定

圖2 烯丙孕素質(zhì)譜圖

圖3 睪酮質(zhì)譜圖

圖4 空白血漿總離子流圖

圖5 烯丙孕素對照品(1 ng/mL)加內(nèi)標(biāo)(睪酮)總離子流圖

圖6 空白血漿添加烯丙孕素(1 ng/mL)與內(nèi)標(biāo)(睪酮)總離子流圖

2.4.2 記憶效應(yīng) 結(jié)果表明，烯丙孕素的記憶效應(yīng)均在最低定量下限的20%以內(nèi)，且內(nèi)標(biāo)物(睪酮)不超過定量下限內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。在后續(xù)真實(shí)樣品分析中，仍然會考察每一批樣品的UPLC-MS/MS系統(tǒng)的記憶效應(yīng)。

表3 記憶效應(yīng)檢測

注：N/A為檢測不到。

Note:N/A means can't be detected.

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果見表4。由表4可知，烯丙孕素在豬空白血漿添加水平為1 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的濃度時(shí)基質(zhì)效應(yīng)在109.23%～114.65%，定量下限相對基質(zhì)效應(yīng)的CV 為 8.05%，小于 15%，符合 EMEA 指導(dǎo)原則的規(guī)定。結(jié)果表明，豬的空白血漿對烯丙孕素測定的基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.5.1 儲備液穩(wěn)定性 烯丙孕素和內(nèi)標(biāo)物儲備液的穩(wěn)定性測定結(jié)果分別見表5。結(jié)果表明，烯丙孕素和內(nèi)標(biāo)物在-20℃凍存條件下放置6個月仍可保持穩(wěn)定。

2.5.2 樣品貯存穩(wěn)定性 血漿樣品貯存期間穩(wěn)定性測定結(jié)果見表6。結(jié)果表明，血漿樣品在-20℃凍存條件下放置，待測物至少可保持穩(wěn)定3個月。

2.5.3 上樣液在分析室中的穩(wěn)定性 上樣液在分析室中的穩(wěn)定性測定結(jié)果見表7。結(jié)果表明，上樣液中待測物烯丙孕素和內(nèi)標(biāo)物睪酮在分析室內(nèi)分析期間可保持穩(wěn)定性達(dá)8 h。

表4 基質(zhì)效應(yīng)對待測藥物的影響

表5 -20℃儲存下烯丙孕素儲備液的穩(wěn)定性測定結(jié)果

表6 血漿樣品在-20℃凍存下待測物的穩(wěn)定性測定結(jié)果

表7 分析室內(nèi)(4℃)放置8 h后上樣液中烯丙孕素的穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.5.4 反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性 經(jīng)3次循環(huán)凍融后血漿樣品中烯丙孕素的測定結(jié)果見表8。結(jié)果表明，循環(huán)凍融對血漿樣品中烯丙孕素的穩(wěn)定性無影響。

表8 3個凍融循環(huán)(+25℃/-20℃)后血漿樣品中烯丙孕素的穩(wěn)定性測定結(jié)果

3 討論

目前國內(nèi)外有關(guān)烯丙孕素在豬血漿中含量測定方法未見報(bào)道。鑒于烯丙孕素在豬血漿含量很低，因此本試驗(yàn)采用了UPLC-MS/MS定量分析方法對用藥后豬血漿中的含量進(jìn)行定量分析。在提取劑的選擇方面，分別考察了文獻(xiàn)報(bào)道中的乙腈和乙酸乙酯提取劑[11]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈在提取回收率和除蛋白的能力強(qiáng)于乙酸乙酯，故選用乙腈作為提取劑。在色譜柱的選擇上，曾試用過Kromasil C8(2.0×50 mm，5 μm)色譜柱，流動相為5 mmol/L甲酸銨水溶液和甲醇，但存在峰拖尾現(xiàn)象，在調(diào)試過流動相pH值、流動相比例、梯度洗脫程序、甲酸銨水溶液濃度后沒有明顯改善，最后采用了C4色譜柱。在流動相的選擇上，在試驗(yàn)過程中曾試用過乙醇和甲酸銨水溶液流動相，但系統(tǒng)壓力過大，不利于系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)，也曾試過甲醇和甲酸銨水溶液流動相，但峰形不好看，分離效果不好。在洗脫程序上，試過等度洗脫，但峰寬過寬，且峰形不好看，最后確定采用梯度洗脫。在內(nèi)標(biāo)法定量的選擇上，優(yōu)點(diǎn)是測定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。在內(nèi)標(biāo)物睪酮的選擇上，睪酮和烯丙孕素都是激素類，且在色譜圖能相互分開，不受彼此影響，故選用睪酮作為內(nèi)標(biāo)物。關(guān)于線性范圍，烯丙孕素高于100 ng/mL后，線性關(guān)系不再良好，且容易造成系統(tǒng)的記憶效應(yīng)，因此將線性范圍定為1 ng/mL～100 ng/mL。從準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，試驗(yàn)誤差比較小，采用內(nèi)標(biāo)法可精準(zhǔn)定量。本試驗(yàn)建立的豬血漿樣品中烯丙孕素提取和含量測定方法，具有快捷有效、操作簡單、專屬性強(qiáng)、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，適用于豬血漿中烯丙孕素含量的定量分析，可用于烯丙孕素藥物代謝動力學(xué)及生物利用度的研究。

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