陳麗娜,奐劍波，史成和，袁丹鳳，代 維 ，周繼紅，韓志海*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，海軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100048;2.海軍總醫(yī)院海戰(zhàn)傷救治研究中心，北京 100048; 3.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室，重慶 400042)

浸泡性體溫過(guò)低癥指人員意外墜落低溫湖水或海難等原因?qū)е碌捏w溫過(guò)低癥，又稱為急性體溫過(guò)低癥。低溫浸泡對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)均產(chǎn)生影響，可引起血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等損傷[1]，危害落海人員的生命健康。目前有一些學(xué)者對(duì)海水浸泡合并復(fù)合傷的病理生理和損傷機(jī)制研究[2-3]，但是單純低溫海水浸泡損傷的病理生理研究較少。本試驗(yàn)采用未麻醉大鼠模型，觀察單純低溫海水浸泡5 h后，大鼠血常規(guī)、凝血功能、肝腎功能和心肝腎肺組織病結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步深入研究海水浸泡體溫過(guò)低癥的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性普通級(jí)SD大鼠20只，體重210 g±20 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)海軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器設(shè)備 溫度記錄器(iButton,型號(hào)DS1922L,Maxim/Dallas公司生產(chǎn))，自制圓柱狀鼠籠(高20 cm，直徑6 cm)，水銀溫度計(jì)，光學(xué)顯微鏡，人工海水(廣州益爾生物工程有限公司，按照比例配制成含鹽為30 g/L的海水)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腹腔溫度記錄器的植入 大鼠腹腔注射15 g/L戊巴比妥0.4 mL/100 g，麻醉后，下腹部備皮、消毒,取劍突下右側(cè)切開(kāi)2 cm左右切口，將提前用石蠟包裹好的溫度記錄器放入大鼠肝臟下方，醫(yī)用縫合線縫合和消毒，傷口涂抹紅霉素軟膏和腹腔注射青霉素，手術(shù)后持續(xù)3 d。10 d后選取腹部傷口完全愈合，活動(dòng)自如體重穩(wěn)定增長(zhǎng)，飲食排便良好的大鼠備用。

1.2.2 動(dòng)物分組與試驗(yàn) 取上述預(yù)置溫度傳感器的20只SD大鼠。按照隨機(jī)數(shù)字編號(hào)分為正常組和低溫組，每組10只。試驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水，室溫為21℃±0.5℃，大鼠固定在自制的圓柱狀鼠籠內(nèi)，直立放入海水中，鼠籠高20 cm，直徑6 cm，正常組大鼠室溫放置，低溫組大鼠浸泡在15℃±0.5℃人工海水中，水位達(dá)胸骨上端，與上肢齊平，頭露在水面以上。觀察浸泡過(guò)程中大鼠的活動(dòng)意識(shí)、呼吸、心率等生理指標(biāo)。浸泡5 h時(shí)，腹主動(dòng)脈采血，分別注入紫色、藍(lán)色、紅色真空采血管內(nèi)，送到第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行血常規(guī)、凝血和肝腎功能的檢測(cè)。腹主動(dòng)脈放血后，分別剪取黃豆大小的肝臟、腎臟、心臟和肺組織，用冷生理鹽水洗去血液，50 mL/L多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)酒精梯度脫水、石蠟包埋切片，行HE染色，制成病理切片，光鏡下觀察各組織病理變化[4]。取出腹腔內(nèi)的溫度記錄器，采用專用軟件讀出大鼠腹腔各時(shí)間點(diǎn)的溫度，繪制5 h內(nèi)大鼠腹腔溫度變化曲線。正常組大鼠處理同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腹腔溫度的變化

試驗(yàn)前，正常組和低溫組大鼠的腹腔溫度分別為37.25℃±0.38℃和37.01℃±0.26℃，兩者無(wú)明顯差異(P>0.05)。浸泡30 min時(shí)，低溫組大鼠的腹腔溫度明顯下降，2 h下降到15.73℃±0.36℃，與正常組相比，兩者有顯著性差異(P<0.05)。2 h以后，低溫組大鼠的腹腔溫度趨于平穩(wěn)，接近水溫。試驗(yàn)期間正常組大鼠的腹腔溫度變化不明顯(圖1)。

圖1 兩組大鼠腹腔溫度的變化

2.2 生理狀態(tài)的觀察

浸泡0～30 min，低溫組大鼠四肢活動(dòng)增加，上下竄動(dòng)，欲逃離冷水面，呼吸心率逐漸增加，肌顫增加，鼻、耳朵、四肢顏色由粉紅逐漸變成白色，30 min后大鼠肢體活動(dòng)下降，呼吸、心率減弱，2 h左右大鼠肌顫消失，處于半昏迷狀態(tài)，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，呼吸、心率微弱(表1)。浸泡5 h，大鼠活動(dòng)意識(shí)消失，呼吸和心率不易察覺(jué)，對(duì)外界刺激幾乎沒(méi)有反應(yīng)，根據(jù)大鼠經(jīng)典的6級(jí)活動(dòng)意識(shí)狀態(tài)分級(jí)，大鼠處于Ⅵ級(jí)為昏迷狀態(tài)。試驗(yàn)期間，正常組大鼠的活動(dòng)意識(shí)、呼吸及心率變化不明顯，未出現(xiàn)肌顫。

表1 浸泡2 h內(nèi)大鼠呼吸、心率和肌顫的變化

2.3 血常規(guī)、凝血和肝腎功能的變化

與正常組相比，低溫組大鼠血液中白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)明顯減少，紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)及中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)增加，均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)及國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)比率(PT-INR)增加，均存在顯著差異(P<0.05),纖維蛋白原(FIB)輕度降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)明顯增加，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血尿素(SUN)和肌酐(Scr)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鉀離子[K+]和氯離子[Cl-]濃度輕度升高，陰離子間隙(AG)降低，但均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，鈉離子[Na+]濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.4 心、肝、腎、肺組織病理學(xué)變化

剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，低溫組與正常組大鼠的心臟、腎臟、肝臟未見(jiàn)明顯差異。光學(xué)顯微鏡下，正常組大鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維肌絲排列規(guī)整，低溫組心肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯損傷，心肌纖維無(wú)斷裂，間質(zhì)無(wú)出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。光學(xué)顯微鏡顯示，正常組大鼠腎組織腎小球、腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，低溫組見(jiàn)腎組織結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)變性壞死，腎小球無(wú)明顯損傷，間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。正常組肝組織HE染色見(jiàn)肝細(xì)胞及肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝竇排列整齊，低溫組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)基本正常，肝竇排列尚整齊，肝小葉中央靜脈及周邊的肝竇明顯淤血，細(xì)胞間隙有散在出血點(diǎn)，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出(圖4)。

剖檢觀察顯示,正常組肺組織顏色呈淡粉紅色，表面光滑，質(zhì)地較軟，無(wú)明顯出血及壞死。顯微鏡下觀察到肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔較薄，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量散在紅細(xì)胞。低溫組，肺組織呈暗紅色，質(zhì)地稍硬，淤血水腫，顯微鏡下見(jiàn)肺泡間隔顯著增厚，肺泡有擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)少量水腫液，肺毛細(xì)血管廣泛淤血，肺間質(zhì)散在性出血伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

表2 體溫過(guò)低癥大鼠血液臨床常見(jiàn)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

注：與正常組比較#P<0.05，*P<0.01。

Note :Compared with the normothermia group,#P<0.05，*P<0.01。

3 討論

浸泡性體溫過(guò)低癥可導(dǎo)致全身各系統(tǒng)損傷，對(duì)各組織器官和生理功能產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體血常規(guī)和各器官功能改變，雖然冷應(yīng)激與浸泡性體溫過(guò)低癥試驗(yàn)均置于冷環(huán)境中，但冷應(yīng)激試驗(yàn)中動(dòng)物的核心體溫并未明顯下降和意識(shí)昏迷，且在低體溫狀態(tài)維持一段時(shí)間，兩者損傷既有聯(lián)系又有區(qū)別。目前浸泡性體溫過(guò)低癥的很多研究仍然停留在動(dòng)物試驗(yàn)上，主要以麻醉動(dòng)物為主，但前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，麻醉藥物對(duì)低溫浸泡大鼠的活動(dòng)意識(shí)、呼吸及心率等產(chǎn)生明顯抑制。該試驗(yàn)建立未麻醉大鼠模型，將大鼠放入自制鼠籠中，除了頭部以外其余身體完全浸泡在海水中，保證不被淹溺，同時(shí)溫度記錄器可以連續(xù)記錄大鼠的腹腔溫度變化，溫度曲線顯示，15℃海水浸泡后，大鼠的腹腔溫度呈斷崖式下降，2 h左右下降至略高于水溫的低溫狀態(tài)。本試驗(yàn)主要觀察低溫海水浸泡5 h后，大鼠血常規(guī)、凝血、肝腎功能及心、肝、腎、肺組織病理學(xué)的改變。

試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫組大鼠血液中RBC、HGB、HCT及NEU%均明顯增加，主要原因?yàn)榈蜏貞?yīng)激引起外周血管強(qiáng)烈收縮，同時(shí)血液中的成分從血管中轉(zhuǎn)移到組織間隙，導(dǎo)致血容量減少，血液濃縮，粘滯性增加，從而引起各指標(biāo)的增加。血液中PLT明顯降低的可能原因?yàn)榈蜏亟菀鹞⒀軆?nèi)皮細(xì)胞受損，并且短暫性抑制肝脾造血功能。低溫浸泡后，血液中PT、APTT及PT-INR明顯增加，與低溫導(dǎo)致凝血酶活性降低有關(guān)。Tsuei B J等人將低溫、酸中毒和凝血功能紊亂稱為“死亡三聯(lián)癥”，低溫導(dǎo)致凝血功能障礙，凝血功能障礙加重低溫的并發(fā)癥。

低溫組血清中AST和ALT明顯升高，說(shuō)明低溫浸泡引起肝功能合成酶的活性改變，肝功能受到一定的損傷，病理也發(fā)現(xiàn)肝組織中肝竇明顯淤血及間質(zhì)散在出血，有文獻(xiàn)報(bào)道較短時(shí)間低溫浸泡建立的低溫癥模型未觀察到明顯肝病理學(xué)改變[5]，而本試驗(yàn)低溫維持時(shí)間較長(zhǎng)。低溫浸泡后血清中SUN和Scr均有所升高，K+和Cl-輕度升高及Na+輕度降低，表明腎功能損傷，可能原因?yàn)榈蜏卮碳ひ鹧苊黠@收縮及心臟泵血減少，機(jī)體血容量不足，不能夠滿足全身臟器需求，血液優(yōu)先供應(yīng)腦、心臟等重要臟器，腎組織因灌注不足功能受到損傷。剖檢和光鏡觀察發(fā)現(xiàn)腎組織無(wú)明顯損傷，說(shuō)明本試驗(yàn)條件下，雖然腎組織結(jié)構(gòu)尚正常，但其功能已經(jīng)受損。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)心臟剖檢和病理組織學(xué)無(wú)明顯改變，說(shuō)明一定程度的低溫，不會(huì)對(duì)心肌造成嚴(yán)重?fù)p傷，可能與低溫維持時(shí)間及浸泡溫度有關(guān)。

C.正常組; D.低溫組 C.Normothermia group; D.Hypothermia group

E.正常組; F.低溫組E.Normothermia group; F.Hypothermia group

A.正常組; B.低溫組A.Normothermia group; B.Hypothermia group

G.正常組; H.低溫組G.Normothermia group; H.Hypothermia group

低溫浸泡后，大鼠肺組織的剖檢和病理組織學(xué)均表現(xiàn)不同程度損傷。肺組織出現(xiàn)不同程度的出血和水腫，肺泡間隔明顯增厚，出現(xiàn)肺出血，說(shuō)明該低溫浸泡條件下，對(duì)肺組織損傷較突出，可能與應(yīng)激、酸中毒、凝血等綜合因素有關(guān)。肺臟為空腔臟器，極易受到外界刺激因素的影響，并且低溫浸泡對(duì)呼吸產(chǎn)生明顯抑制，缺血缺氧也可引起機(jī)體產(chǎn)生混合型酸堿紊亂，同時(shí)低溫導(dǎo)致的凝血功能障礙和心輸出量下降，也增加肺淤血及肺栓塞的發(fā)生率，最終表現(xiàn)嚴(yán)重的肺功能損傷，嚴(yán)重者可直接導(dǎo)致呼吸驟停[6]，加重低溫癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。臨床上也發(fā)現(xiàn)低溫浸泡患者肺水腫和ARDS的發(fā)生率很高[7]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)浸泡性體溫過(guò)低癥導(dǎo)致機(jī)體肺組織嚴(yán)重?fù)p傷，但復(fù)溫過(guò)程中是否會(huì)加重?fù)p傷目前仍不清楚。

本試驗(yàn)中海水浸泡5 h后，大鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)、血常規(guī)、凝血、肝腎功能及器官組織病理學(xué)變化等基本符合重度低溫癥的表現(xiàn)。對(duì)于臨床上低溫癥患者救治時(shí)，需要重點(diǎn)關(guān)注這些指標(biāo)的改變，這些指標(biāo)的異常與臨床上低溫癥個(gè)案患者的損傷有很大關(guān)聯(lián)性[8]，因此，該模型可以用于海水浸泡性體溫過(guò)低癥損傷機(jī)制的研究。本試驗(yàn)初步觀察了機(jī)體的各種損傷，為以后從分子生物學(xué)的角度闡述低溫浸泡傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，最終提高低溫癥患者的救治率。

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