楊金凱，韓 超，李得鑫，侯海峰，張清波，秦建華，史萬(wàn)玉*，包永占*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/中獸醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000；2.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北保定 071000；3.石家莊先鋒動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河北石家莊 050000)

魚腥黨參散是按照傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論，從《飼料目錄》中選取魚腥草、黨參等可飼用天然植物，組成的一個(gè)可飼用天然植物組方，具有益氣扶正、清熱解毒、通經(jīng)散淤的功效。前期研究已表明魚腥黨參散可以顯著降低奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)，提示其具有抑制奶牛乳房炎的作用。為了進(jìn)一步闡明魚腥黨參散的抗炎機(jī)制，本文通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，通過測(cè)定魚腥黨參散對(duì)細(xì)胞因子及NF-κB信號(hào)通路的影響，初步闡明其抗炎作用機(jī)理，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥品和試劑 魚腥黨參散由魚腥草、黨參等藥物組成，石家莊九鼎動(dòng)物藥業(yè)公司提供；LPS(批號(hào)121M4024V)，MTT，Sigma公司產(chǎn)品；DMEM(高糖)，DMSO，北京索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；Griess法NO檢測(cè)試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10非即用型ELISA檢測(cè)試劑盒，R&D公司產(chǎn)品；蛋白濃度檢測(cè)試劑，Thermo公司產(chǎn)品；一抗，CST公司產(chǎn)品；二抗，康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；顯色液，百智生物科技有限公司產(chǎn)品；BSA,Biotopped公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 SYNERGY HTX全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，BioTek公司產(chǎn)品；Series II Water Jacket二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；CKX41光學(xué)顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)膜儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 魚腥黨參散的制備 將原藥首次加500 mL蒸餾水浸泡1 h，文火煎煮40 min，第2次加8倍量蒸餾水，文火煎煮30 min，第3次加6倍量蒸餾水，文火煎煮20 min，每次煎煮完后用8層紗布過濾，濃縮至 1 g生藥/mL，過濾滅菌，4℃保存。

1.2.2 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度約為5×105個(gè)/mL，每孔100 μL細(xì)胞混懸液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，待其貼壁且恢復(fù)至靜息狀態(tài)。吸棄全部培養(yǎng)液。針對(duì)不同組別加入含不同成分的DMEM(高糖)培養(yǎng)液各100 μL，具體為：對(duì)照組，加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液；LPS組，LPS終濃度為1 μg/mL的DMEM(高糖)培養(yǎng)液；魚腥黨參散組，在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為1g/mL的魚腥黨參散母液，0.22 μm過濾后稀釋，魚腥黨參散組終濃度分別為8、7、6、5、4、3 mg/mL，每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組均加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。終止培養(yǎng)，吸棄全部液體，各組均加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

1.2.3 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

1.2.3.1 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 RAW264.7細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度約為5×105個(gè)/mL，每孔2 mL細(xì)胞混懸液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。吸棄全部培養(yǎng)液，針對(duì)不同組別加入含不同成分的DMEM(高糖)培養(yǎng)液2 mL，具體為：對(duì)照組及LPS組，加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液；用藥組，在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為1 g/mL的魚腥黨參散母液，0.22 μm過濾后稀釋，魚腥黨參散組終濃度分別為5、2.5、1.25 mg/mL，下同，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)4 h。預(yù)處理后吸棄全部培養(yǎng)液，對(duì)照組加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液；LPS組及各用藥組加入含LPS(終濃度為1 μg/mL)的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用Griess法試劑盒測(cè)定各組樣品的NO含量。

1.2.3.2 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的影響 細(xì)胞處理同1.2.2。于培養(yǎng)達(dá)24 h時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組樣品的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量。

1.2.4 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7細(xì)胞p65和IκB以及P-p65和P-IκB蛋白表達(dá)量的影響 細(xì)胞處理同1.2.2。培養(yǎng)達(dá)24 h時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白并定量后電印跡轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，50 g/L BSA(牛血清白蛋白)封閉液搖床封閉過夜，搖床孵育一抗(稀釋度1∶1 000)2 h，TBST洗膜3次，AP標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶2 000)，搖床孵育2 h，TBST洗膜3次,在暗室中使用BCIP/NBT試劑顯色，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 魚腥黨參散對(duì)細(xì)胞活性的影響

濃度≤6 mg/mL的魚腥黨參散在24 h內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)毒性作用，OD值與對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)。后續(xù)試驗(yàn)中的藥物劑量均在安全范圍內(nèi)選取(圖1)。

**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01)

2.2 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7分泌NO的影響

LPS組細(xì)胞在致炎藥物刺激24 h后，其NO分泌量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。細(xì)胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護(hù)后再經(jīng)LPS刺激24 h，魚腥黨參散各劑量組的NO分泌量均極顯著低于LPS組(P<0.01)，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即在用藥安全范圍內(nèi)，藥物濃度越高抑制NO分泌的效果越好(圖2)。

2.3 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的影響

LPS組細(xì)胞在致炎藥物刺激24 h后，其TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10分泌量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。細(xì)胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護(hù)后再經(jīng)LPS刺激24 h，魚腥黨參散各劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的分泌量均極顯著低于LPS組(P<0.01)，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即在用藥安全范圍內(nèi)，藥物濃度越高抑制TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10分泌的效果越好(圖3)。

2.4 魚腥黨參散對(duì)RAW264.7細(xì)胞p65和IκB以及P-p65和P-IκB蛋白表達(dá)量的影響

LPS組細(xì)胞在致炎藥物刺激24 h后，其P-p65和P-IκB蛋白表達(dá)量明顯增加，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。細(xì)胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護(hù)后再經(jīng)LPS刺激24 h，魚腥黨參散各劑量組的P-p65和P-IκB蛋白表達(dá)量均極顯著低于LPS組(P<0.01)(圖4)。各藥物組均能夠極顯著降低p65和IκB蛋白的磷酸化水平，p65和IκB蛋白的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)(圖5)。

**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)

** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01); ## indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01)

圖2魚腥黨參散對(duì)RAW264.7分泌NO的影響

Fig.2 Effects of YuxingDangshen-San on NO secretion in RAW264.7

**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)

** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01); ## indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01)

圖3魚腥黨參散對(duì)RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的影響

Fig.3 Effects of YuxingDangshen-San on TNF-α、IL-1β、IL-6 and IL-10 secretions in RAW264.7

圖4魚腥黨參散對(duì)P-p65和P-IκB蛋白表達(dá)量的影響

Fig.4 Effects of YuxingDangshen-San on protein expression levels of P-p65 and P-IκB

**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)

** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01); ## indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01)

圖5魚腥黨參散對(duì)p65和IκB蛋白表達(dá)量的影響

Fig.5 Effects of YuxingDangshen-San on protein expression levels of p65 and IκB

3 討論

炎癥反應(yīng)是臨床常見的病理過程，是指動(dòng)物機(jī)體針對(duì)促炎因子、致炎因素、外界對(duì)機(jī)體的刺激發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的應(yīng)答反應(yīng)，以局部組織的變質(zhì)、滲出和增生變化為主要表現(xiàn)[1]。巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、組織再生、影響造血和清除衰老細(xì)胞等多種生理功能。正常情況下，巨噬細(xì)胞不表現(xiàn)其免疫功能，但當(dāng)受到脂多糖(LPS)、微生物、γ干擾素等外界刺激時(shí)，會(huì)被激活，產(chǎn)生并釋放大量的NO、IL-6、TNF-α及IL-1β等炎癥介質(zhì)參與機(jī)體急性炎癥應(yīng)答，引起炎癥損傷[2-3]。因此，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞是研究炎癥機(jī)制的很好的炎癥細(xì)胞模型[4]。

在免疫性炎癥發(fā)病進(jìn)程中，體內(nèi)NO水平升高可從多個(gè)途徑影響病理進(jìn)程[5-6]，如NO在高濃度狀態(tài)下，激活NF-κB，誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等的產(chǎn)生，IL-1和TNF-α的產(chǎn)生又能激活iNOS，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的NO，從而形成正反饋循環(huán)，使細(xì)胞因子的分泌以及其NO自身的表達(dá)得以持續(xù)，使炎癥反應(yīng)更持久，更劇烈[7]。NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，它以p50/p65異源二聚體形式存在，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)與致炎性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，全身炎癥反應(yīng)中伴有多器官NF-κB的活化，介導(dǎo)多種炎癥基因的表達(dá)[8]。正常情況下，NF-κB復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)主要以p50/p65-IκB異源三聚體的形式存在于細(xì)胞漿中，在LPS作用于細(xì)胞后，NF-κB被活化，IκB被磷酸化，從而釋放出NF-κB異源二聚體，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化的p65蛋白在核內(nèi)能夠結(jié)合于DNA特定的κB位點(diǎn)，啟動(dòng)TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[9-11]。

有研究表明，魚腥草可抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-8及丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗炎、抗氧化作用[12]。魚腥草以70℃蒸餾水浸泡5 h所得水提取物可抑制抗原誘導(dǎo)的IκB-α的降解和NF-κB的活化[13]。從黨參中分離出的三帖皂苷，發(fā)現(xiàn)其有抗炎活性，可以通過靶向LPS/TLR4復(fù)合物來抑制脂多糖誘發(fā)的炎癥，還可以通過抑制NF-κB的活性來改善TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的癥狀[14]。這與本試驗(yàn)對(duì)魚腥黨參散的研究結(jié)果相似。

本試驗(yàn)中LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后，NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等的分泌量均極顯著提高(P<0.01)，說明體外炎癥模型的建立成功。試驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度魚腥黨參散保護(hù)4h后，能夠極顯著抑制RAW264.7細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6(P<0.01)，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。對(duì)于抑炎因子IL-10，本試驗(yàn)中未見其有顯著升高，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后，p65蛋白的磷酸化水平極顯著升高(P<0.01)，提示更多具有活性的p65蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)參與對(duì)相關(guān)基因的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)。在LPS作用于RAW264.7細(xì)胞后，NF-κB信號(hào)通路被激活，IκB蛋白發(fā)生磷酸化后被降解，發(fā)揮相應(yīng)的介導(dǎo)作用。LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后，能夠極顯著降低IκB和p65蛋白的表達(dá)量，經(jīng)不同濃度魚腥黨參散保護(hù)4 h后，與LPS對(duì)照組進(jìn)行比較，各藥物組均能夠極顯著降低IκB和p65蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，IκB和p65蛋白的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，說明魚腥黨參散可以通過阻斷細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活發(fā)揮其抗炎作用。魚腥黨參散對(duì)JAK-STAT和MAPK通路的影響還有待進(jìn)一步的研究。

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