謝 昆，譚玉婷，王 靖，趙 昱，張成桂，楊自忠

(1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南蒙自 661199；2.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實驗室,云南蒙自 661199；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實驗室，云南大理 671003)

昆蟲體液免疫的主要方式之一是通過血淋巴中的脂肪體細(xì)胞應(yīng)答微生物的感染，誘導(dǎo)抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)的表達(dá)[1]。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，其基因組測序已經(jīng)完成[2]，在此基礎(chǔ)上，Cheng T等通過BLAST搜索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了35個家蠶抗菌肽基因序列[3]，后經(jīng)不同研究者注釋和鑒定，目前確認(rèn)的結(jié)果是，在家蠶基因組中存在7個抗菌肽基因家族，即BmCecropin、BmMoricin、BmGloverin、BmAttacin、BmLebocin、BmEnbocin和BmDefensin，它們根據(jù)序列同源性的不同又可以分為不同的亞族，其中BmCecropin具有廣譜的抗革蘭陽性和陰性菌特性，具有12個基因，6個屬于B亞家族成員(BmCecropinB1-B6)，其余6個分屬于A、D和E亞家族成員[4]。BmCecropinD是BmCecropin家族中一個重要的成員，具有廣譜抗菌活性和強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)活性，在家蠶抵御外界病原微生物入侵方面具有重要作用[5]。自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是William S F于2005年發(fā)現(xiàn)的，該系統(tǒng)中含有一定比例的葡萄糖和乳糖，葡萄糖耗盡后乳糖才被利用，目的蛋白開始表達(dá)[6]。自誘導(dǎo)表達(dá)的最終菌體密度大，蛋白產(chǎn)量高，而且沒有毒性，適于重組蛋白的高效表達(dá)[7]。本研究以5齡7日家蠶中腸組織為材料，設(shè)計特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增BmCecropinD基因，構(gòu)建pET32a-BmCecropinD原核表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BmCecropinD重組蛋白，為該蛋白的抑菌活性研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶(青松×皓月)由蒙自家蠶養(yǎng)殖戶提供；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；T4 DNA鏈接酶，限制性核酸內(nèi)切酶為賽默飛世爾科技(中國)有限公司公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、RT-PCR試劑盒、高分子量預(yù)染蛋白Marker為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上公布的BmCecropinD(NM-001043368.2)mRNA序列，應(yīng)用Primer Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計一對特異性引物如下：F：5′- CAGTCCATGGGCAACTTCTTCAAGGATC-3′，R：5′-CCGCTCGAGTCATTGTCCGAGAGCTTTTGCTTTTG-3′；下劃線部分為NcoⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增 取5齡7日家蠶中腸組織，應(yīng)用RNAiso Plus提取總RNA，方法參考《分子克隆實驗指南》。應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR試劑盒，RT-PCR擴(kuò)增出BmCecropinD抗菌肽基因，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 表達(dá)載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定 DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用NcoⅠ/XhoⅠ分別雙酶切BmCecropinD基因和pET32a載體，構(gòu)建pET32a-BmCecropinD原核表達(dá)載體，連接，轉(zhuǎn)化，酶切鑒定，PCR鑒定等參考《分子克隆實驗指南》。

1.2.4 BmCecropinD基因的序列測定和分析 將鑒定為陽性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，應(yīng)用DNA Star軟件對測定的BmCecropinD基因進(jìn)行序列分析、同源性比較和進(jìn)化樹分析。

1.2.5 重組蛋白的IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，分別收集誘導(dǎo)0 h～6 h菌液，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá) 按照William S F的方法進(jìn)行自誘導(dǎo)表達(dá)研究[2]。挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到4 mL含有100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，再按1% 的接種量接種到10 mL含有100 μg/mL Amp的ZYM-5052 培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12、14、16、18、20、22 h，收集菌液，與IPTG誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，比較兩者重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的差異。

2 結(jié)果

2.1 家蠶抗菌肽基因的RT-PCR擴(kuò)增

以5齡7日(5L7D)時期家蠶的中腸組織總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增家蠶BmCecropinD抗菌肽基因，結(jié)果顯示目的基因大小約為186 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.BmCecropinD基因的RT-PCR擴(kuò)增; 2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.RT-PCR amplification of BmCecropinD gene; 2.Negative control

圖1家蠶抗菌肽基因的RT-PCR擴(kuò)增

Fig.1 RT-PCR amplification of BmCecropinD gene

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建的pET32a-BmCecropinD原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果表明外源基因大小與RT-PCR結(jié)果一致，說明得到的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒(圖2，圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～12.含pET32a-BmCecropinD質(zhì)粒的菌液PCR鑒定

M.DNA Marker DL 2 000; 1-12.PCR identification of bacterial liquid carrying pET32a-BmCecropinD plasid

圖2重組質(zhì)粒的PCR鑒定

Fig.2 PCR identification of recombinant plasmids

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.pET32a-BmCecropinD重組質(zhì)粒的NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Identification of pET32a-BmCecropinD recombinant plasmid byNcoⅠ/XhoⅠ

圖3重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.3 Identification of recombinant plasmids by double enzyme digestion

2.3 BmCecropinD基因的序列測定及分析

鑒定為陽性的菌株，經(jīng)大連寶生物公司測序后，得到了BmCecropinD基因的全序列(圖4)。該基因全長186 bp,編碼61個氨基酸。與GenBank中發(fā)表的犬BmCecropinD基因序列比較有1個位點(diǎn)不一致，但不影響氨基酸的編碼。

圖4 BmCecropinD基因序列測定結(jié)果

2.4 BmCecropinD基因編碼的氨基酸序列分析

克隆的BmCecropinD基因編碼61個氨基酸(圖5)，預(yù)測等電點(diǎn)為10.0，與GenBank上發(fā)表的GenBmCecropinD氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)有1個氨基酸發(fā)生突變，由異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T)。

2.5 BmCecropinD抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與抗原性分析

用DNAStar 對克隆BmCecropinD基因序列編碼的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與抗原性分析后,可以看到BmCecropinD基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)具有4個α-螺旋,無β-折疊,1個β-轉(zhuǎn)角和3個無規(guī)則卷曲。抗原性強(qiáng)的氨基酸位點(diǎn)在30-38位，非抗原性的氨基酸位點(diǎn)在6-20位點(diǎn)，親水性少,說明BmCecropinD 抗菌肽疏水性強(qiáng)( 圖6) 。

2.6 抗菌肽重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

BmCecropinD抗菌肽分別經(jīng)1 mmol/L濃度IPTG誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6 h和自誘導(dǎo)表達(dá)12、14、16、18、20、22 h后，SDS-PAGE電泳檢測顯示IPTG和自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)皆能成功表達(dá)BmCecropinD重組蛋白(圖7箭頭)，凝膠成像掃描儀掃描結(jié)果顯示自誘導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)16h表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)率最高達(dá)到29%(12泳道)，高于IPTG誘導(dǎo)組(表1)。從圖7中也可以看出，自誘導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)率明顯高于IPTG誘導(dǎo)組。

圖5 BmCecropinD基因編碼的氨基酸序列分析

Fig.5 Analysis of amino acid sequence encoded by BmCecropinD gene

圖6 BmCecropinD蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與抗原性分析

泳道 Lane1234567891011121314表達(dá)產(chǎn)率/%Expression yield31.310.213.415.117.216.815.720.222.524.52928.428.7

3 討論

抗菌肽存在于大量昆蟲細(xì)胞中，在正常組織中含量很低，分離純化難度大，化學(xué)合成的成本十分昂貴。因此，通過基因工程技術(shù)獲得的抗菌肽成為首選方法[8]。一般pET載體系統(tǒng)采用非代謝性乳糖類似物異丙基-β-D-巰基半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)，但由于IPTG 具有潛在的毒性，對菌體生長有一定的抑制作用，且價格昂貴，目前國內(nèi)外已有很多研究用乳糖代替IPTG作為乳糖啟動子的誘導(dǎo)劑[9]。當(dāng)葡萄糖被耗盡后，細(xì)菌利用乳糖表達(dá)外源蛋白[6]。自誘導(dǎo)表達(dá)的最終菌體密度大，蛋白產(chǎn)量高，而且沒有毒性，適于重組蛋白的高效表達(dá)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.含pET32a空質(zhì)粒的菌液; 2～8.IPTG分別誘導(dǎo)0,1,2,3,4,5,6 h重組菌株; 9～14.自誘導(dǎo)12,14,16,18,20,22 h重組菌株

M.Protein molecular weight Marker; 1.Bacterial liquid carrying pET32a empty plasmid; 2-8.Recombinant bacteria induced by IPTG for 0,1,2,3,4,5 and 6 hours,respectively; 9-14.BmCecropinD expressions by auto-induction for 12,14,16,18,20,22 hours

圖7 SDS-PAGE檢測BmCecropinD抗菌肽表達(dá)產(chǎn)率

Fig.7 The detection of expressing yields of BmCecropinD antibacterial peptide by SDS-PAGE

自然界中大多數(shù)多細(xì)胞生物活在與微生物經(jīng)常接觸和各種逆境脅迫的環(huán)境中。這些生物的生存依賴于體內(nèi)各種成分參與的宿主防御體系。在高等脊椎動物中，宿主防御依賴于兩種類型的免疫反應(yīng)，即天然免疫和獲得性免疫，在昆蟲中等無脊椎動物中，宿主防御僅僅依賴于天然免疫[10]。昆蟲的免疫反應(yīng)是一個非常敏感快捷的系統(tǒng)，因此能夠有效的抵御外源物質(zhì)的侵襲。免疫應(yīng)答主要依賴于三種反應(yīng)：①血細(xì)胞對入侵外源物質(zhì)的吞噬和包被作用，稱為細(xì)胞免疫；②蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，即當(dāng)昆蟲受到各種傷害刺激后，能夠迅速引起酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)和血液凝集反應(yīng)—黑化反應(yīng)；③當(dāng)昆蟲受到感染后脂肪體或血細(xì)胞快速合成大量的抗菌肽分子，并且迅速釋放到血淋巴中。后面兩種反應(yīng)方式構(gòu)成了昆蟲的體液免疫[11-12]。

家蠶的體液免疫主要依賴血液中的抗菌肽和蛋白質(zhì)，抗菌肽有很強(qiáng)的抗菌活性，值得深入研究。在家蠶中有近40個抗菌肽基因被發(fā)現(xiàn)，其中BmCecropinD抗菌肽具有極強(qiáng)的抗菌活性[13]。通過RT-PCR技術(shù)從5齡7日家蠶中腸組織中克隆BmcecropinD抗菌肽基因，構(gòu)建pET32a-BmcecropinD重組表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在大腸埃希菌中對重組蛋白進(jìn)行自誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率最高達(dá)到29%，明顯高于IPTG誘導(dǎo)結(jié)果，為家蠶抗菌肽的純化、活性鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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