（懷化市公安局刑事偵查支隊，湖南 懷化 418000）

含有3～5個堿基重復單元的STR基因座是法醫(yī)學常用遺傳標記，主要表現(xiàn)為長度多態(tài)性，可用于個體識別及親權鑒定[1-2]。其中，根據(jù)STR基因座核心序列結構的重復情況，可以分為簡單重復結構、復合重復結構及復雜重復結構[3]。常用的毛細管電泳檢測平臺主要根據(jù)等位基因片段長度的大小及熒光素標記技術對STR基因座各等位基因進行讀取和分析，檢測方便且成本低，但無法獲取內部序列結構信息[3-4]。目前，隨著二代測序技術的快速發(fā)展及成本的大幅下降，基于二代測序技術對STR基因座進行分析已成為研究熱點[5-6]。本研究主要采用美國Thermo Fisher Scientific公司推出的基于Ion PGMTMTorrent平臺的Early Access STR Kit v1對湖南地區(qū)24名漢族無關個體進行24個常染色體STR基因座和Amelogenin基因座的分型檢測，探討二代測序技術進行STR基因座檢測分析的可行性。

1 材料與方法

采集湖南地區(qū)24名漢族無關個體的外周血樣本，其中男性12名，女性12名。血樣均稀釋至0.5ng/μL備用。采用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒（德國QIAGEN公司）進行DNA提取，用Quantifiler?Human DNA Quantification試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行DNA定量。本研究采用DNA標準品9948（美國Promega公司）作為陽性對照。

采用Early Access STR Kit v1（美國Thermo Fisher Scientific公司）對上述24份檢材及DNA標準品9948進行文庫構建、文庫定量、乳液PCR反應、文庫富集、二代測序及結果分析。文庫構建PCR體系為20μL，包括EA STR PCR 2.5×PCR反應混合物 v1 8 μL、EA STR 10×PCR引物混合物v1 2μL和基因組DNA（gDNA）1ng，其余體積用超純水補齊。文庫構建PCR采用28個循環(huán)數(shù)，具體操作參照試劑盒說明書進行。定量后文庫稀釋為20 pmol/L。采用Ion PGMTMHi-QTMOT2 200試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對15μL稀釋文庫進行乳液PCR及富集反應。對富集后的產(chǎn)物在Ion PGMTMTorrent平臺上采用Ion PGMTMHi-QTMSequencing程序進行測序檢測，F(xiàn)low數(shù)為850。采用Ion 318TMChip v2芯片對24個樣本和標準品9948進行并行檢測，重復一次。測序數(shù)據(jù)采用插件HID STR Genotyper v3.0進行分析。

對上述樣本采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒［基點認知技術（北京）有限公司］和華夏TM白金PCR擴增試劑盒（美國AB公司）進行24個常染色體STR基因座和Amelogenin基因座的PCR擴增。擴增產(chǎn)物在3500基因分析儀（美國AB公司）上進行毛細管電泳檢測，采用GeneMapperTMID-X v1.4軟件進行結果分型。

2 結果與討論

Early Access STR Kit v1中含有的24個常染色體STR基因座信息及相關序列結構信息見表1。

本研究采用Ion 318TMChip v2芯片對24個樣本和標準品9948進行兩次并行檢測，分型結果一致。兩次測序的芯片有效數(shù)據(jù)率分別為62.38%和65.64%，可用于進一步分析。各基因座上獲取的測序數(shù)據(jù)可分為等位基因測序信息、Stutter測序信息及噪音信息[5-6]。將各STR基因座獲取的等位基因測序信息與總測序信息量之比作為衡量測序數(shù)據(jù)有效率的評價指標。結果顯示，24個常染色體STR基因座的數(shù)據(jù)有效率在65.32%（D2S1776）～88.69%（TPOX），平均測序讀深為484X（D1S1677）～6434X（D19S433）。

同時，24個常染色體STR基因座及Amelogenin基因座檢測到的等位基因與毛細管電泳檢測結果一致。24個常染色體STR基因座的序列等位基因信息見表2。其中，在 D1S1656、D4S2408、D5S2500、D21S11、D2S441、D2S1338、D3S1358、D8S1179 和 vWA 基因座中均檢見序列多態(tài)性，這也是二代測序技術相較于毛細管電泳的優(yōu)勢之一，有助于親緣關系的進一步分析及突變事件的分析[5-6]。

表1 Early Access STR Kit v1中24個常染色體STR基因座序列結構信息

表2 24個常染色體STR基因座等位基因及序列結構信息 （n=24）

表2（續(xù)）

表2（續(xù)）

上述研究結果表明，采用Early Access STR Kit v1不僅可以實現(xiàn)多個遺傳標記（24個常染色體STR基因座和Amelogenin基因座）的并行檢測，同時也可以對多個樣本實現(xiàn)并行檢測，從而節(jié)約樣本檢測量及檢測時間。本研究采用1ng DNA進行文庫構建及后續(xù)測序分析，檢測結果可靠，數(shù)據(jù)量大，但是實驗過程及結果分析較毛細管電泳更為復雜。該技術不僅可以實現(xiàn)STR基因座的內部序列結構解析，同時可以獲取其側翼序列結構存在的變異信息，是未來法醫(yī)學STR基因座研究及應用的有效手段。

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本期文章中可直接使用的縮略詞

死亡時間（postmortem interval，PMI）

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）

β-肌動蛋白（beta-actin，ACTB）

腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）

置信區(qū)間（confidence interval，CI）

呼吸（respiration，R）

脈搏（pulse，P）

血壓（blood pressure，BP）

體質量指數(shù)（body mass index，BMI）

重癥監(jiān)護病房（intensive care units，ICU）

計算機斷層掃描（computed tomography，CT）

多層螺旋 CT（multi-slice spiral CT，MSCT）

計算機X線攝影（computed radiography，CR）

數(shù)字化X線攝影（digital radiography，DR）

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）

信使 RNA（messenger RNA，mRNA）

線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）

核糖體 DNA（ribosomal DNA，rDNA）

短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）

相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）

雜合度（heterozygosity，H）

期望雜合度（expected heterozygosity，He）

觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）

個體識別率（discrimination power，DP）

累積個體識別率（cumulative discrimination power，CDP）

多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）

非父排除率（probability of paternity exclusion，PE）

三聯(lián)體非父排除率（probability of excluding paternity in trios，PEtrio）

二聯(lián)體非父排除率（probability of excluding paternity in duos，PEduo）

累積非父排除率（cumulative probability of paternity exclusion，CPE）

匹配概率（probability of matching，Pm）

基因多樣性（gene diversity，GD）

父權指數(shù)（paternity index，PI）

累積父權指數(shù)（combined paternity index，PI）

最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）

DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)（combined DNA index system，CODIS）

局部序列排比搜索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）

蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）

基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）