畢 鋼 ，張 晨 ，董 研 ，焦海濤 ，董 雷 ，周懷谷

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；2.無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫 214174；3.烏魯木齊市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830063）

目前，法醫(yī)物證DNA個(gè)體識(shí)別檢驗(yàn)主要采用常染色體STR分型試劑盒，父系遺傳檢驗(yàn)主要采用Y染色體STR分型試劑盒。有些情況下，個(gè)體識(shí)別和父系遺傳檢驗(yàn)需同時(shí)進(jìn)行，為解決兩種試劑盒分別檢驗(yàn)帶來人力物力的浪費(fèi)，以及物證量微帶來的檢驗(yàn)困難等難題，本課題組采用EX16+10Y試劑盒對(duì)4620份新疆維吾爾族男性個(gè)體血樣同時(shí)檢測(cè)15個(gè)常染色體STR基因座和10個(gè)Y染色體STR（Y-STR）基因座，評(píng)估EX16+10Y試劑盒的檢測(cè)效能。

1 材料與方法

1.1 樣本

保存在FTA卡上的男性血液樣本4620份，樣本為隨機(jī)采集的新疆維吾爾族未知關(guān)系個(gè)體，血樣貢獻(xiàn)者均為志愿者，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

EX16+10Y試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）。3130xl基因分析儀、9700型PCR儀（美國AB公司），DB-100A手動(dòng)打孔儀（北京達(dá)博創(chuàng)新科技開發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本準(zhǔn)備

采用DB-100A手動(dòng)打孔儀截取直徑1.2mm FTA血樣卡濾紙放入96孔板，直接采用EX16+10Y試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)以9948A為陽性對(duì)照，以去離子水為陰性對(duì)照。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

1.3.2.1 STR基因座信息

EX16+10Y試劑盒中常染色體基因座包括：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、vWA、D5S818、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51；Y染色體基因座包括：DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS456、DYS458、DYS635、DYS385a/b。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增條件

總反應(yīng)體積 25 μL，包括：反應(yīng)混合物 10 μL，引物混合物 5 μL，熱啟動(dòng) Taq 酶 1 μL（5 U），1.2 mm 濾紙片，去離子水9 μL。其中反應(yīng)混合物：Mg2+終濃度0.9 mg/L，dNTP終濃度 0.28 mmol/L，BSA 終濃度0.9 mg/L，Tris-HCl 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，四甲基氯化胺10mmol/L，NaN30.008%。

PCR反應(yīng)程序：95℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃1min，72℃ 1min，循環(huán) 33 次；70℃ 1h；4℃持續(xù)。

1.3.3 電泳分析

PCR產(chǎn)物用3130xl基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper?ID v3.2軟件進(jìn)行基因型分析。當(dāng)分型圖譜的峰值大于100RFU時(shí)，滿足檢驗(yàn)分析要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用PowerMarker V3.25[1]計(jì)算常染色體STR基因座觀察雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC），采用Powerstate軟件計(jì)算個(gè)體識(shí)別率（DP）、匹配概率（Pm）、三聯(lián)體非父排除率（PEtrio）。對(duì)各基因座等位基因進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析。

Y-STR基因座等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，基因多樣性（GD）計(jì)算公式為：

式中，n為樣本數(shù)，Pi為單倍型頻率。

2 結(jié) 果

2.1 15個(gè)常染色體STR基因座分型結(jié)果

4620份血樣全部獲得清晰的分型圖譜，峰值大于100RFU，滿足檢驗(yàn)要求。等位基因的堿基數(shù)與Ladder相應(yīng)等位基因的堿基數(shù)偏差介于±0.5 bp。陽性參照物9948的分型結(jié)果正確，均衡性好，陰性參照物無基因峰。

15個(gè)常染色體STR基因座的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05），Ho 為 0.637～0.838，PIC為 0.580～0.860，DP 為 0.811～0.978，累積個(gè)體識(shí)別率為0.99999999999999999。三聯(lián)體累積非父排除率（CPE）達(dá)0.999998084，滿足親子鑒定需要。15個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表1。

表1 15個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)（n=4620）

2.2 10個(gè)Y-STR基因座的遺傳多態(tài)性

10個(gè)Y-STR基因座在4620份新疆維吾爾族男性個(gè)體中共觀察到766種單倍型，具有8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)相同單倍型的分別為20、10、2人。DYS391的GD值最低（0.4537），DYS385a/b 的GD 值最高（0.9232）。YSTR基因座的等位基因頻率分布和GD值見表2～3。

表2 新疆維吾爾族人群10個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率 （n=4620）

表3 新疆維吾爾族人群10個(gè)Y-STR基因座的GD值（n=4620）

3 討 論

STR基因座分型是目前主要的法醫(yī)檢驗(yàn)方法，探索如何增強(qiáng)STR基因座分型檢驗(yàn)效能有實(shí)際意義。一般常染色體STR復(fù)合擴(kuò)增用于個(gè)體識(shí)別，Y-STR復(fù)合擴(kuò)增用于家系排查，這樣分別檢驗(yàn)，能滿足部分工作的需要，如僅需要個(gè)體識(shí)別的案件或前科人員庫的建立。在某些案件中，需要同時(shí)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別或家系排查，若將常染色體STR和Y-STR基因座同時(shí)擴(kuò)增，能提高檢材利用率，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，為案件快速偵破提供幫助。

EX16+10Y試劑盒中15個(gè)常染色體STR基因座和AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司）中基因座完全相同，和DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)（CODIS）結(jié)合方便，便于實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比對(duì)和共享。15 個(gè)常染色體 STR 基因座的 DP〉0.8、Ho〉0.7（除 TPOX外），聯(lián)合應(yīng)用可用于同一認(rèn)定。PE值高，滿足三聯(lián)體親子鑒定要求。相關(guān)研究董研等[2-3]已有報(bào)道。

EX16+16Y試劑盒中10個(gè)Y-STR基因座選擇了AmpF?STRTMYfilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司）中多態(tài)性較高的基因座。本研究中所有男性樣本在Y-STR基因座均只檢出1個(gè)等位基因。多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，DYS391的GD值最低，為0.4537，DYS385a/b的GD值最高，為0.9232。與周衛(wèi)江等[4]用AmpF?STRTMYfilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)288名新疆維吾爾族群體的多態(tài)性研究進(jìn)行了數(shù)據(jù)比對(duì)，GD值經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為驗(yàn)證檢驗(yàn)結(jié)果，我們對(duì)調(diào)查樣本進(jìn)行了實(shí)地調(diào)查，10個(gè)Y-STR基因座不相同者無血緣關(guān)系。結(jié)果表明，EX16+10Y試劑盒能滿足大批量排查工作。但也有部分10個(gè)Y-STR基因座分型相同者，并未顯示有血緣關(guān)系，對(duì)于這種情況，可通過增加Y-STR基因座檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)他們是否為同一家族。后期我們將開發(fā)EX16+16Y試劑盒，以提高排查的準(zhǔn)確性。

[1]劉亞舉，張俊濤.幾款遺傳學(xué)分析軟件在法醫(yī)生物統(tǒng)計(jì)中的應(yīng)用[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，32（1）：62-64.

[2]董研，林雙雙，曹禹，等.15個(gè)常染色體和10個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的研發(fā)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（5）：373-376，380.

[3]ZHOU H，BI G，ZHANG C，et al.Developmental validation of forensic DNA-STR kits：Expressmarker 16+10Y and expressmarker 16+18Y[J].Forensic Sci Int Genet，2016，24：1-17.

[4]周衛(wèi)江，李平.新疆維吾爾族群體16個(gè)Y-STR基因座遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（1）：61-62.