（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，許多案（事）件都需要測(cè)定活體或尸體血液中的乙醇含量。當(dāng)案發(fā)時(shí)間和采樣時(shí)間存在時(shí)間差時(shí)，還需對(duì)案發(fā)當(dāng)時(shí)的血乙醇含量進(jìn)行回推[1]，從而合理地解釋乙醇對(duì)機(jī)體的影響。因此，系統(tǒng)了解乙醇在體內(nèi)代謝過(guò)程及其影響因素對(duì)法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中乙醇檢測(cè)結(jié)果的解釋和評(píng)價(jià)有重要意義。

乙醇進(jìn)入體內(nèi)后，主要通過(guò)乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）參與的氧化途徑進(jìn)行代謝[2]。ADH和ALDH對(duì)應(yīng)的基因編碼區(qū)存在單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，會(huì)引起對(duì)應(yīng)酶結(jié)構(gòu)和功能的變化，影響乙醇體內(nèi)代謝。ADH1B*2/*2（rs1229984）純合子對(duì)應(yīng)的酶活性是ADH1B*1/*1純合子個(gè)體的40倍，催化乙醇快速氧化為乙醛；ADH1C*1（rs698）所編碼的酶氧化乙醇的能力是ADH1C*2所編碼的酶的2.5倍[3]；ALDH2*2（rs671）編碼的亞基，影響ALDH2四聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致酶活性顯著降低，乙醛在體內(nèi)蓄積[4]。

中國(guó)漢族人群中約33%的個(gè)體攜帶一個(gè)ALDH2*2等位基因，84%～92%攜帶一個(gè)ADH1B*2等位基因，83%是ADH1C*1/*1純合子[5]。在前期ALDH2對(duì)乙醇代謝影響研究[6]的基礎(chǔ)上，本研究提高飲酒劑量，增加樣本量，探討ADH1B和ALDH2的基因多態(tài)性及飲酒種類對(duì)乙醇代謝的影響，為司法鑒定實(shí)踐中涉及乙醇代謝結(jié)果解釋或乙醇含量回推的案件提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本研究志愿者均為四川大學(xué)在校學(xué)生，漢族，常規(guī)體檢正常，告知試驗(yàn)流程后，簽署知情同意書，填寫《明尼蘇達(dá)多相人格測(cè)驗(yàn)》（399版本）、《乙醇使用障礙篩查量表》[7]和《密西根乙醇依賴調(diào)查表》，根據(jù)評(píng)分值，提示存在精神障礙和乙醇依賴問(wèn)題的，不納入本次研究。本研究由四川大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

本研究共篩選出81名合格志愿者，其中男性60名，女性 21名，平均年齡為（22.4±2.4）歲，平均身高為（170.2±7.0）cm，平均體質(zhì)量為（62.4±11.2）kg，平均體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為（21.4±3.0）kg/m2。

1.2 基因型測(cè)定

采集志愿者肘靜脈血2mL，用QIAamp DNA Investigator試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）提取總DNA。在已報(bào)道的ADH1B和ALDH2的多重SNaPshot分型方法[8]基礎(chǔ)上，修改ADH1B和ALDH2的延伸引物，加入ADH1C擴(kuò)增和延伸引物，采用PRISM?SNaP-shotTMMultiplex試劑盒（美國(guó)AB公司）建立同時(shí)檢測(cè)ADH1B、ADH1C和ALDH2基因上3個(gè)SNP位點(diǎn)（rs1229984、rs698 和 rs671）的多重 SNaPshot分型方法，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3 飲酒實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前一周禁酒，志愿者在醫(yī)護(hù)人員監(jiān)護(hù)下進(jìn)行飲酒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用酒為瀘州老窖特曲（52度），劑量為1.0g/kg，在30min內(nèi)勻速飲完，伴食花生。在飲酒前以及飲酒后 30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6 h、7 h和8 h經(jīng)留置針靜脈采血1 mL。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室建立的頂空氣相色譜法[6]檢測(cè)血中乙醇和乙醛的濃度。同時(shí)，記錄各時(shí)間點(diǎn)志愿者臉紅、心悸等不適情況。

本研究還考察了飲酒種類對(duì)乙醇代謝的影響，在81名志愿者中選取10名ADH1B、ADH1C和ALDH2基因型均相同的個(gè)體開展3次飲酒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用酒分別為瀘州老窖特曲（52度）、青島啤酒（4.3度）、守望堡赤霞珠紅葡萄酒（14.5度），實(shí)驗(yàn)過(guò)程同上，劑量為0.8g/kg，每次實(shí)驗(yàn)間隔1個(gè)月。

1.4 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)檢測(cè)所得各時(shí)間點(diǎn)血中乙醇和乙醛的濃度，獲得乙醇達(dá)峰時(shí)間（Tmax，單位：h）、乙醇峰值質(zhì)量濃度（Cmax，單位：mg/dL）數(shù)據(jù)；計(jì)算乙醇曲線下面積（area under curve，AUC乙醇，單位：mg·h/dL）和 AUC乙醛（單位：μmol·h/L）；運(yùn)用最小二乘法對(duì)血乙醇消除相進(jìn)行線性擬合，獲得乙醇消除斜率（β）[9-10]和線性相關(guān)系數(shù)（r）。

根據(jù)基因型將志愿者分組，描繪各組的血藥濃度-時(shí)間曲線（簡(jiǎn)稱“藥時(shí)曲線”），統(tǒng)計(jì)各組 Tmax、Cmax、AUC乙醇、AUC乙醛和 β 數(shù)據(jù)，以±s表示。 采用 SPSS 21.0軟件對(duì)各組的上述參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并運(yùn)用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行組間比較。不同基因間的相互作用關(guān)系采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）。對(duì)3種飲酒種類組間的各參數(shù)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果和討論

2.1 乙醇消除斜率的分布

本研究81名志愿者累計(jì)進(jìn)行飲酒實(shí)驗(yàn)111次。結(jié)果顯示，血乙醇達(dá)最大質(zhì)量濃度后，部分出現(xiàn)一段平臺(tái)期，大部分則很快進(jìn)入消除期，血乙醇質(zhì)量濃度呈線性下降，r值為-0.9917±0.0081。因此，根據(jù)線性回歸關(guān)系回推乙醇質(zhì)量濃度是合理的。

本研究中111次乙醇消除斜率絕對(duì)值的區(qū)間分布見圖1，最小絕對(duì)值為6.2181mg·h/dL，最大絕對(duì)值為 26.654mg·h/dL，平均絕對(duì)值為 13.828mg·h/dL，與卓先義等[1]報(bào)道的中國(guó)漢族人群乙醇消除斜率的平均絕對(duì)值（13.6mg·h/dL）基本一致。對(duì)于大部分志愿者的藥時(shí)曲線，在血乙醇質(zhì)量濃度低于20mg/dL后，血乙醇轉(zhuǎn)為指數(shù)曲線消除。

圖1 血液中乙醇消除斜率絕對(duì)值的區(qū)間分布

2.2 基因型分組及對(duì)應(yīng)的藥時(shí)曲線

通過(guò)本研究建立的多重SNaPshot方法，成功獲得81名志愿者ADH1B、ADH1C和ALDH2的分型結(jié)果。因本研究著重關(guān)注ADH1B和ALDH2基因多態(tài)性對(duì)乙醇代謝的影響，為排除ADH1C基因多態(tài)性的干擾，從志愿者中篩選出攜帶ADH1C*1/*1純合子的個(gè)體，共71人。然后，根據(jù)ADH1B和ALDH2的基因型將志愿者分為4組：ALDH2*1/*1-ADH1B*1/*2，16 人；ALDH2*1/*1-ADH1B*2/*2，24 人；ALDH2*1/*2-ADH1B*1/*2，12 人；ALDH2*1/*2-ADH1B*2/*2，13 人；剩余6人因基因型人數(shù)較少，未單獨(dú)分組討論。各基因型組血中乙醇、乙醛平均藥時(shí)曲線分別見圖2。

2.3 基因多態(tài)性對(duì)乙醇代謝的影響

各基因型組 Tmax、Cmax、AUC乙醇、β 和 AUC乙醛比較結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，不同基因型組間Tmax和Cmax值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在ALDH2*1/*2基因型個(gè)體中，ADH1B*2/*2組 AUC乙醇值低于 ADH1B*1/*2組（P〈0.05）；在 ALDH2*1/*1基因型個(gè)體中，ADH1B*2/*2組β 絕對(duì)值高于 ADH1B*1/*2 組（P〈0.05）；在 ADH1B*2/*2基因型個(gè)體中，ALDH2*1/*1組β絕對(duì)值高于ALDH2*1/*2組（P〈0.05）。 在兩種 ADH1B 基因型個(gè)體中，ALDH2*1/*2組AUC乙醛值均高于ALDH2*1/*1組（P〈0.05）。雙因素方差分析結(jié)果顯示，ADH1B基因與AUC乙醇有關(guān)，而 ALDH2基因與 AUC乙醛有關(guān)，且兩基因在AUC乙醇和AUC乙醛上無(wú)交互作用（表2）。

圖2 各基因型組血乙醇和乙醛的平均藥時(shí)曲線

表1 不同基因型組 Tmax、Cmax、AUC乙醇、β 和 AUC乙醛比較結(jié)果 （±s）

表1 不同基因型組 Tmax、Cmax、AUC乙醇、β 和 AUC乙醛比較結(jié)果 （±s）

注：1）與 ALDH2*1/*2-ADH1B*1/*2 比較，P〈0.05；2）與 ALDH2*1/*1-ADH1B*1/*2 比較，P〈0.05；3）與 ALDH2*1/*1-ADH1B*2/*2比較，P〈0.05

ALDH2*1/*2-ADH1B*2/*2（n=13）Tmax/h 1.45±0.65 1.61±0.84 1.15±0.64 1.40±0.69 Cmax/（mg·dL-1） 88.41±27.40 88.59±24.40 94.00±23.20 78.33±14.55 AUC乙醇/（mg·h·dL-1） 408.60±101.79 381.80±98.06 443.38±143.63 339.91±100.321）β-12.51±2.92 -14.92±3.262） -12.30±2.85 -12.08±2.673）AUC乙醛/（μmol·h·L-1） 43.31±28.06 50.22±58.22 226.74±117.032） 214.59±107.493）參數(shù) ALDH2*1/*1-ADH1B*1/*2（n=16）ALDH2*1/*1-ADH1B*2/*2（n=24）ALDH2*1/*2-ADH1B*1/*2（n=12）

表2 ALDH2和ADH1B基因?qū)UC乙醇、AUC乙醛的影響

ADH1B*2/*2純合子個(gè)體的ADH活性較ADH1B*1/*2雜合子高，能更快地將乙醇代謝為乙醛[11]。因此，理論上ADH1B*2/*2基因型個(gè)體β絕對(duì)值應(yīng)大于ADH1B*1/*2個(gè)體。本研究發(fā)現(xiàn)的ALDH2*1/*1基因型個(gè)體中，ADH1B*2/*2組的β絕對(duì)值高于ADH1B*1/*2組，與上述推論一致。然而此發(fā)現(xiàn)并不存在于ALDH2*1/*2基因型個(gè)體中，推測(cè)可能是因?yàn)锳LDH2*1/*2基因型個(gè)體體內(nèi)乙醛的累積抑制了ADH1B的酶活性[12]，對(duì)ADH1B*2/*2編碼的高活性ADH1B影響更強(qiáng)。盡管ALDH2*1/*2基因型個(gè)體中ADH1B組間Tmax、Cmax及β值差異不大，但ADH1B*2/*2組的AUC乙醇卻低于ADH1B*1/*2組。推測(cè)AUC乙醇值較低的原因在于，整個(gè)代謝過(guò)程中ADH1B*2/*2基因型組的血乙醇質(zhì)量濃度均低于ADH1B*1/*2基因型組（圖2A），因此進(jìn)入體循環(huán)的乙醇總量較低。

攜帶ALDH2*2等位基因的個(gè)體，其編碼的ALDH活性顯著降低，進(jìn)而引起血中乙醛的累積，在既往研究[13-14]中已得到確證，本研究中各基因型組間AUC乙醛的比較結(jié)果也支持上述觀點(diǎn)。此外，在飲酒過(guò)程中，我們觀察到ALDH2*1/*2基因型攜帶者出現(xiàn)明顯的臉紅、心悸等不適反應(yīng)，也正是乙醛蓄積產(chǎn)生的毒理作用。

關(guān)于ADH1B對(duì)血中乙醛濃度的影響，有研究[15]報(bào)道，將含rADH-47His突變cDNA的腺病毒載體注射到大鼠，模擬人類ADH1B突變，該大鼠在給予乙醇后能引起動(dòng)脈血乙醛濃度短時(shí)增加，但人體實(shí)驗(yàn)[16-17]結(jié)論與其并不一致。本研究結(jié)果顯示，在控制ALDH2基因型后，ADH1B*2/*2純合子攜帶者的AUC乙醛與ADH1B*1/*2雜合子差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 飲酒種類對(duì)乙醇代謝的影響

根據(jù)基因分型結(jié)果篩選出的10名基因型相同的志愿者，基因型均為ADH1C*1/*1-ADH1B*2/*2-ALDH2*1/*1，參與白酒、紅酒和啤酒3種不同類型酒的飲酒實(shí)驗(yàn)，獲得 Tmax、Cmax、AUC乙醇、β 和 AUC乙醛值。經(jīng)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析后結(jié)果顯示，白酒、紅酒、啤酒3種類型酒組間上述參數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05，表3）。個(gè)體攝取相同劑量不同類型的酒時(shí)，乙醇吸收進(jìn)入體內(nèi)的速度只有微小差異[18]，本研究初步顯示，個(gè)體攝取相同劑量不同類型的酒時(shí)，血乙醇代謝及乙醛蓄積也無(wú)差異。

表3 不同飲酒類型各參數(shù)分析 （n=10，±s）

表3 不同飲酒類型各參數(shù)分析 （n=10，±s）

參數(shù) 白酒 紅酒 啤酒 F值 P值Tmax/h 1.13±0.57 1.43±0.47 1.23±0.30 2.066 0.156 Cmax/（mg·dL-1） 93.71±26.63 74.61±15.46 81.23±18.35 2.617 0.101 AUC乙醇/（mg·h·dL-1） 320.56±103.89 275.87±61.51 303.02±110.54 0.860 0.440 β-15.87±3.81 -16.64±4.94 -14.85±2.56 0.761 0.482 AUC乙醛/（μmol·h·L-1） 68.23±23.88 54.30±23.66 76.46±39.05 1.191 0.327

綜上，本研究報(bào)道了中國(guó)漢族人群在較高劑量[19]飲酒時(shí)，不同ADH1B和ALDH2基因型個(gè)體體內(nèi)乙醇代謝和乙醛蓄積的情況。另外，還考察了飲酒種類對(duì)乙醇代謝的影響，初步發(fā)現(xiàn)機(jī)體乙醇代謝受相關(guān)基因多態(tài)性影響較大，基本不受飲酒種類的影響。在司法鑒定實(shí)踐中解釋乙醇相關(guān)問(wèn)題或?qū)ρ掖己窟M(jìn)行回推時(shí)，必要時(shí)需考慮乙醇代謝酶相關(guān)基因的多樣性。但是，本研究樣本量較少，限制了基因型分組，后期研究中還會(huì)增加樣本量，涵蓋更多基因型，同時(shí)考察性別、劑量、飲酒習(xí)慣等因素對(duì)乙醇代謝的影響。

[1]卓先義，卜俊，向平，等.血中酒精濃度的回推算研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（5）：345-347.

[2]EDENBERG H J.The genetics of alcohol metabolism：role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase variants[J].Alcohol Res Health，2007，30（1）：5-13.

[3]BOSRON W F，LI T K.Genetic polymorphism of human liver alcohol and aldehyde dehydrogenases，and their relationship to alcohol metabolism and alcoholism[J].Hepatology，1986，6（3）：502-510.

[4]CRABB D W， EDENBERG H J， BOSRON W F，et al.Genotypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol sensitivity.The inactive ALDH22allele is dominant[J].J Clin Invest，1989，83（1）：314-316.

[5]ENG M Y， LUCZAK S E， WALL T L.ALDH2，ADH1B， and ADH1C genotypes in Asians： a literature review[J].Alcohol Res Health，2007，30（1）：22-27.

[6]熊卉，王薇，葉懿，等.ALDH2基因多態(tài)性與乙醇代謝及外周乙醛積蓄程度的關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（1）：31-35.

[7]李冰，沈漁邨，張伯全，等.《酒精使用障礙篩查量表》（AUDIT）的測(cè)試[J].中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2003，17（1）：1-3.

[8]KANG T S，WOO S W，PARK H J，et al.Comparison of genetic polymorphisms of CYP2E1， ADH2，and ALDH2 genes involved in alcohol metabolism in Koreans and four other ethnic groups[J].J Clin Pharm Ther，2009，34（2）：225-230.

[9]WILSON J R，ERWIN V G.Rate of alcohol metabolism； do not “correct” the beta 60 estimate for comparisons among ethnic groups[J].J Stud Alcohol，1983，44（6）：1093-1096.

[10]WATSON P E， WATSON I D， BATT R D.Prediction ofblood alcoholconcentrationsin human subjects.Updating the Widmark Equation[J].J Stud Alcohol，1981，42（7）：547-556.

[11]DRUESNE-PECOLLO N，TEHARD B，MALLET Y，et al.Alcohol and genetic polymorphisms：effect on risk of alcohol-related cancer[J].Lancet Oncol，2009，10（2）：173-180.

[12]CRABB D W，MATSUMOTO M，CHANG D，et al.Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol-related pathology[J].Proc Nutr Soc，2004，63（1）：49-63.

[13]WALL T L，PETERSON C M， PETERSON K P， et al.Alcohol metabolism in Asian-American men with genetic polymorphisms of aldehyde dehydrogenase[J].Ann Intern Med，1997，127（5）：376-379.

[14]MIZOI Y， YAMAMOTO K， UENO Y， et al.Involvement of genetic polymorphism of alcohol and aldehyde dehydrogenases in individual variation of alcohol metabolism[J].Alcohol Alcohol，1994，29（6）：707-710.

[15]RIVERA-MEZA M，QUINTANILLA M E，TAMPIER L，et al.Mechanism of protection against alcoholism by an alcohol dehydrogenase polymorphism：development of an animal model[J].FASEB J，2010，24（1）：266-274.

[16]PENG G S， CHEN Y C， WANG M F， et al.ALDH2*2 but not ADH1B*2 is a causative variant gene allele for Asian alcohol flushing after a lowdose challenge：correlation of the pharmacokinetic and pharmacodynamic findings[J].Pharmacogenet Genomics，2014，24（12）：607-617.

[17]KANG G，BAE K Y，KIM S W，et al.Effect of the allelic variant of alcohol dehydrogenase ADH1B*2 on ethanol metabolism[J].Alcohol Clin Exp Res，2014，38（6）：1502-1509.

[18]CEDERBAUM A I.Alcohol metabolism[J].Clin Liver Dis，2012，16（4）：667-685.

[19]MAUREL D B， BOISSEAU N， BENHAMOU C L，et al.Alcohol and bone：review of dose effects and mechanisms[J].Osteoporos Int，2012，23（1）：1-16.