李 輝 ，夏 攀 ，王 創(chuàng) ，汪 遠 ，趙雪瑩 ，馬 克 ，戴 維 ，曹 禹 ，周懷谷 ，劉文斌

（1.法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室 上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200083；2.浙江大學(xué)植物生理學(xué)及生物化學(xué)國家重點實驗室，浙江 杭州 310058；3.中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心，上海 201602）

在各類犯罪案件現(xiàn)場的勘驗過程中，除了人體來源的檢材物證外，還可能獲得與犯罪相關(guān)的各種植物類物證。對植物類物證進行來源和種屬的鑒定，往往能夠為案件偵破提供線索和證據(jù)[1]。但是，目前對植物類物證鑒定主要依賴形態(tài)學(xué)方法，一方面對鑒定人員的經(jīng)驗和專業(yè)要求較高，另一方面，受制于現(xiàn)場實際情況，植物類物證通常已經(jīng)破碎、發(fā)霉、腐敗或者缺乏分類學(xué)特征，因此，傳統(tǒng)方法在實際辦案中面臨較大的困難[2]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過DNA鑒定有望使植物類物證的鑒定擺脫形態(tài)學(xué)方法鑒定的局限。根據(jù)一段或者幾段DNA標(biāo)記序列，即DNA條形碼（DNA barcode），來分析鑒定物種，是目前生物鑒定的最新方向[3]。目前在國內(nèi)外植物分類學(xué)研究[3-9]中，有十多個DNA片段以及片段組合被提出作為標(biāo)記進行植物種屬的分析。本研究中，我們選擇了三個基因片段（rbcL、matK、ITS）作為標(biāo)記，嘗試建立一套針對植物類物證的DNA遺傳標(biāo)記鑒定系統(tǒng)，通過對200例已明確種屬特性植物的鑒定結(jié)果評估該鑒定系統(tǒng)的通用性和識別能力。

1 材料與方法

1.1 植物樣本采集

在辰山植物園植物分類學(xué)專家的指導(dǎo)下，收集上海地區(qū)各類常見植物（以野生植物為主，輔以部分引進品種和景觀植物），并根據(jù)形態(tài)學(xué)特點確認物種，共200種（171個屬，80科），每種植物采集葉片部分。

1.2 主要試劑和儀器

DNeasy?Plant Mini試劑盒（德國QIAGEN公司），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒［DP209，天根生化科技（北京）有限公司］，BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

NanoDropTM2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），9700型PCR儀（美國AB公司），3500xL基因分析儀（美國AB公司），ChemiDOC MP凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 植物DNA提取及定量

每個植物樣本取20～100mg，經(jīng)液氮冷凍處理后，研磨成粉末狀，按DNeasy?Plant Mini試劑盒使用說明書提取植物DNA，并使用NanoDropTM2000分光光度計定量后備用。

1.4 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳

PCR 擴增體系包括：DNA 模板 1μL，2×Taq PCR反應(yīng)混合物 15 μL，正向引物 1.25 μL，反向引物1.25 μL，ddH2O 補至 30 μL。 在 9700型 PCR 儀上進行擴增，PCR 反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 20 s，56℃20s，72℃ 40s，32 個循環(huán)；72℃ 10min。根據(jù)文獻[4-5，10]報道篩選出3對通用引物，由美國Thermo Fisher Scientific公司合成序列（表1）。PCR產(chǎn)物用1.2%凝膠在DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀上進行電泳，由ChemiDOC MP凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 DNA標(biāo)記的通用引物序列

1.5 產(chǎn)物回收及測序

根據(jù)產(chǎn)品說明，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對有條帶的PCR產(chǎn)物進行純化。并使用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing試劑盒將純化回收的DNA在3500xL基因分析儀上進行直接測序，測序引物即為擴增引物，對每個產(chǎn)物都采用雙向測序，取重疊部分序列作為測序結(jié)果。

1.6 美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫比對

將測序結(jié)果使用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST進行比對，記錄BLAST結(jié)果中匹配度和覆蓋度較高的物種信息，并進行分析，根據(jù)測序序列可能對應(yīng)的物種，并結(jié)合樣本已確認物種名，將比對結(jié)果記錄為科、科偏屬、科偏種（某些單種屬植物）、屬、屬偏種、種、比中其他科物種，BLAST比對結(jié)果普遍匹配度和覆蓋度都低的記錄為未比中，說明NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有該物種基因序列的記錄。將測序序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對的結(jié)果一般根據(jù)BLAST評分從高到低排列，其參考依據(jù)主要是序列的匹配度和覆蓋度。對于某些同一科植物，可能在單個片段序列上相似，但該科下的某個屬植物的BLAST評分略高于該科下的其他屬，但是差異僅為十幾個甚至幾個堿基，不能排除其為其他屬的可能性，故表述為“科偏屬”，“屬偏種”同理；而“科偏種”的表述主要是指某些屬只有一個物種，而又與同科其他屬比較相近的情況。

2 結(jié) 果

2.1 植物DNA提取及定量

利用DNeasy?Plant Mini試劑盒提取后所得DNA的量不同，NanoDropTM2000分光光度計定量后質(zhì)量濃度范圍為 4.0～58.9ng/μL。

2.2 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳

絕大多數(shù)植物樣本在rbcL、matK、ITS三個片段的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳都能得到明亮的單一條帶（圖1）。其中，rbcL擴增成功199種，成功率為99.5%；matK擴增成功185種，成功率為92.5%；ITS擴增成功200種，成功率為100%。

圖1 部分植物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 DNA測序及NCBI數(shù)據(jù)庫比對

所有PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后雙向測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，結(jié)果見表2。另外，在ITS片段的擴增產(chǎn)物中，有16例樣本擴增產(chǎn)物比對到真菌及12例樣本擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果呈雙峰無法進行BLAST比對，所以ITS實際的有效擴增成功率為86.0%（172/200）。

表2 不同DNA標(biāo)記鑒定能力統(tǒng)計 （例）

3 討 論

法醫(yī)植物學(xué)是法庭科學(xué)中有待開發(fā)的領(lǐng)域[11]，植物類物證的DNA遺傳標(biāo)記鑒定是近年來法醫(yī)植物學(xué)研究的主要方向[12]。利用DNA標(biāo)記鑒定物種在各個領(lǐng)域中都有著廣泛的前景。在動物中，利用線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因作為標(biāo)記進行鑒定，成功率達到95%以上[13]，已經(jīng)成為國際通用的物種鑒定技術(shù)，廣泛應(yīng)用于法醫(yī)、海關(guān)和加工食品等的鑒定。在本研究中，我們建立了一套包含多個DNA標(biāo)記片段的植物類物證鑒定系統(tǒng)，并通過大量不同物種的植物樣本來評價其鑒定的識別能力。選擇的三個作為鑒定標(biāo)記的基因片段中，rbcL和matK是第三屆國際DNA條形碼會議上被推薦作為植物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼的核心標(biāo)記[6]，而ITS是中國植物條形碼協(xié)會進一步建議的補充標(biāo)記[7]。

從瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果來看，絕大多數(shù)植物樣本都能得到明亮的單一條帶，其中rbcL和matK的擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后都能得到理想的測序序列，rbcL引物的通用性略高于matK，而ITS雖然得到了100%（200/200）的明亮的單一條帶，但經(jīng)過測序后發(fā)現(xiàn)12個樣本測序結(jié)果呈雙峰，無法進行BLAST比對，另外16個樣本擴增產(chǎn)物比對到真菌，所以ITS實際的檢測成功率為86.0%（172/200）。因此，三個片段標(biāo)記的檢測成功率為rbcL〉matK〉ITS，三個標(biāo)記的引物總體都具有較好的通用性。而關(guān)于ITS產(chǎn)物檢測出真菌的問題，分析認為，不同于葉綠體基因片段rbcL和matK，ITS是核基因片段，是真核生物rDNA中5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列，這段序列植物與真菌都擁有，如果在樣本DNA提取過程中混入了植物上附帶的真菌DNA，當(dāng)樣本植物的DNA量相對較低時，PCR擴增過程中真菌序列占據(jù)上風(fēng)，被大量復(fù)制，BLAST比對出真菌序列。此外，擴增產(chǎn)物受真菌影響測序結(jié)果呈雙峰時，則無法進行比對。

從測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST比對結(jié)果來看，rbcL的識別能力大多數(shù)情況下只能達到屬水平，與之前的研究一致，KRESS等[8]認為rbcL的變異只存在于種以上的分類水平，在單個物種水平上變異不大，因此只適合作為屬水平或者以上的分類。matK的識別能力優(yōu)于rbcL，但引物通用性不如rbcL[9]。綜上所述，以rbcL+matK作為組合優(yōu)于單rbcL或者單matK的識別能力，仍然不足以達到物種水平，其識別能力主要集中在屬及屬以上水平。ITS作為植物DNA鑒定標(biāo)記的潛力在近年來的研究中已逐步得到了認可[13]。但是鑒于ITS檢測結(jié)果的不穩(wěn)定性，不適合作為單標(biāo)記進行鑒定，可作為rbcL+matK組合的有力補充，在本研究中，當(dāng)以rbcL+matK+ITS組合進行鑒定時，識別能力明顯提高（表2），對大部分樣本能夠達到屬及屬以下水平。

當(dāng)不同標(biāo)記片段比對結(jié)果出現(xiàn)矛盾時，需要進一步綜合分析，必要時加入新的片段進行補充鑒定。如126號植物rbcL和matK的比對結(jié)果不同，rbcL比對到牡荊屬，而matK比對到懸鉤子屬，最后根據(jù)ITS的比對結(jié)果，認定為牡荊屬并且傾向于牡荊物種，與形態(tài)學(xué)上認定的結(jié)果一致。此外，同一物種在NCBI數(shù)據(jù)庫中可能比對到多條匹配度和覆蓋度相似的記錄，需要鑒定人員結(jié)合各個標(biāo)記的比對結(jié)果，綜合判斷。對于某些科的植物，如薔薇科、菊科，rbcL、matK和ITS三個標(biāo)記片段序列都十分相似，rbcL+matK組合往往只能認定到科水平，加上ITS也只能認定到屬，在今后的研究中可能需要加入新的標(biāo)記片段來提高識別能力。綜合目前國內(nèi)外相關(guān)報道以及本研究的內(nèi)容，僅依靠單個DNA標(biāo)記片段來鑒別植物的種屬是十分困難的，但是通過幾個基因片段的組合，達到植物種屬乃至物種的鑒定是可行和有效的[14]。

利用DNA遺傳標(biāo)記對植物種屬進行鑒定的方法在農(nóng)業(yè)、植物學(xué)以及生物分類學(xué)等多個領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，而在法庭科學(xué)領(lǐng)域中，應(yīng)用于植物類物證的鑒定工作尚處于探索階段。本研究通過對上海地區(qū)200例常見植物的DNA提取、擴增和測序，初步建立了一套以rbcL、matK和ITS三個基因片段作為標(biāo)記的植物類物證物種鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有良好的通用性，對于大部分植物樣本的識別能力能夠達到屬及屬以下水平。筆者認為，對于特定地區(qū)的植物類群構(gòu)建DNA數(shù)據(jù)庫，有利于辦案人員能夠快速完成植物類物證物種的鑒定，降低鑒定物種所需的人力和資金成本，使植物種屬鑒定在刑事科學(xué)技術(shù)以及法庭科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮作用。

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