趙琳琳 ，翟仙敦 ，張 振 ，呂 宙 ，夏志遠(yuǎn) ，莫耀南

（1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院，重慶 400031）

法醫(yī)昆蟲學(xué)（forensic entomology）是應(yīng)用昆蟲學(xué)及其他自然科學(xué)的理論與技術(shù)，對(duì)死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）和死亡地點(diǎn)進(jìn)行推斷，從而解決司法實(shí)踐中有關(guān)昆蟲問題的一門科學(xué)。研究[1-4]表明，與尸體腐敗聯(lián)系最緊密的是雙翅目與鞘翅目昆蟲，但鞘翅目昆蟲到達(dá)尸體時(shí)間較晚，而雙翅目昆蟲常常第一時(shí)間到達(dá)尸體，具有更重要的法醫(yī)學(xué)意義，尤其是雙翅目中的麗蠅科、麻蠅科與蠅科。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定要求鑒定人具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，在我國(guó)僅有少數(shù)形態(tài)學(xué)專家具備這方面的能力。鑒于案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)蠅類的多樣性和復(fù)雜性，非昆蟲專業(yè)人員很難依據(jù)其形態(tài)鑒定種屬，因此尋找一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、迅速、通用的方法是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于昆蟲的分子鑒定為嗜尸性蠅類的種屬鑒定開辟了新途徑，其中最常用的是線粒體基因組 COⅠ、COⅡ、16S rRNA 等基因序列[5-6]，核基因組28S rRNA基因序列也逐漸被國(guó)外學(xué)者研究并證實(shí)可以進(jìn)行嗜尸性蠅類的種屬鑒定[2，7]。本研究擬對(duì)嗜尸性蠅類核基因組變異性較大的28S rRNA基因中715bp序列片段進(jìn)行分析，進(jìn)而對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)常見嗜尸性蠅類進(jìn)行種屬鑒定，以方便法醫(yī)昆蟲學(xué)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣本

1.1.1 蠅類樣本采集

放置大鼠尸體于河南科技大學(xué)（洛陽(yáng)）操場(chǎng)樹蔭下誘捕蠅類，之后用離心管分類單獨(dú)密封包裝置于-20℃冰箱中保存。依據(jù)《中國(guó)常見蠅類檢索表》進(jìn)行形態(tài)學(xué)種類鑒定，共捕捉到8只絲光綠蠅Lucilia sericata（Meigen，1826）、1 只 銅 綠 蠅 Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、11 只大頭金蠅 Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、2 只 家 蠅 Musca domestica （Linnaeus，1758）、4 只棕尾別麻蠅 Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy，1830）、3 只 肥 須 亞 麻 蠅 Sarcophaga crassipalpis（Macquart，1839）。

1.1.2 虛擬樣本來(lái)源

虛擬樣本來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）和 EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ebi.ac.uk/），在數(shù)據(jù)庫(kù)中以6種蠅類［絲光綠蠅Lucilia sericata（Meigen，1826）、銅綠蠅 Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、大頭金蠅 Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、家蠅 Musca domestica（Linnaeus，1758）、棕尾別麻蠅 Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy，1830）、肥須亞麻蠅 Sarcophaga crassipalpis（Macquart，1839）］和28S rRNA為關(guān)鍵詞進(jìn)行索引，將大于700bp的序列納入本研究。經(jīng)篩選共得到28條其他地區(qū)的記錄，其中2條為家蠅，詳見表1。

表1 GenBank和EMBL檢索數(shù)據(jù)匯總情況

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

每個(gè)樣本取腿4條，清洗，搗碎，用Chelex-100法提取腿部DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用TaKaRa Ex Taq?試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］對(duì)28S rRNA基因中的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為：上游引物5′-GACTACCCCCTG AATTTAAGCAT-3′；下游引物 5′-GACTCCTTGGTCC GTGTTTCAAG-3′。 擴(kuò)增總體系為 50 μL，包括 10×PCR 緩沖液（含 Mg2+） 5μL，dNTP 混合物（2.5mmol/L）6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 2 μL，5 U/μL 的 Ex Taq?DNA 聚合酶 0.75μL，DNA 模板 6μL，ddH2O 補(bǔ)足。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性1 min；94℃ 1 min，45℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 1 min，50℃ 1.5min，72℃ 1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 8min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。

1.2.3 電泳檢測(cè)及測(cè)序分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（120V 30min），溴化乙錠染色，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序，正反向雙向測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性。應(yīng)用MEGA7.0[8]分析軟件將所測(cè)29個(gè)樣本的基因序列進(jìn)行整理，在BLAST搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)。納入來(lái)自GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的28條相應(yīng)蠅種序列，以家蠅為外群，經(jīng)MEGA7.0分析軟件比對(duì)，剪切為相同長(zhǎng)度，然后按鄰近法（neighbor-joining，NJ）對(duì)序列進(jìn)行堿基組成、進(jìn)化分歧率和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，Bootstrap值為1000。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取及測(cè)序結(jié)果

本研究共獲得3科5屬6種29個(gè)樣本的DNA，DNA提取效果較好，部分樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。與來(lái)自GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的28個(gè)蠅種（含2只家蠅）序列合并分析，獲得片段長(zhǎng)度為715bp。

圖1 部分樣本DNA擴(kuò)增后電泳圖譜

2.2 BLAST比對(duì)結(jié)果

BLAST比對(duì)結(jié)果（表2）顯示所得樣本DNA與GenBank中已知序列一致（相似度均為100%），與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符合。但并未發(fā)現(xiàn)與樣本23、24、25和26一致的基因序列，形態(tài)學(xué)鑒定該4個(gè)樣本為棕尾別麻蠅，GenBank中搜索棕尾別麻蠅Sarcophaga peregrina的28S rRNA基因序列，共有4條記錄，但顯示長(zhǎng)度均約400bp。

表2 29個(gè)樣本28S rRNA基因中715bp序列在線BLAST比對(duì)結(jié)果

表2（續(xù)）

2.3 堿基組成分析

家蠅作為外群除外，對(duì)所得53個(gè)樣本的基因序列進(jìn)行堿基組成分析，結(jié)果顯示：保守位點(diǎn)677個(gè)，可變位點(diǎn)37個(gè)，其中簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)36個(gè)，自裔位點(diǎn)1個(gè)。堿基平均組成：T=34.3%，C=13.2%，A=34.2%，G=18.3%，A+T=68.5%，具有明顯的A+T傾向性。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以家蠅為外群，運(yùn)用MEGA7.0軟件對(duì)其他53個(gè)樣本基因序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果按照不同科、屬、種分別聚類，分子鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致（圖2）。53個(gè)樣本自上而下分別形成2個(gè)群聚，分別代表麗蠅科和麻蠅科。麗蠅科又分為2支，分別代表綠蠅屬和金蠅屬，屬間Bootstrap檢驗(yàn)可信度為81%。綠蠅屬包括17只絲光綠蠅和14只銅綠蠅，兩個(gè)蠅種分別聚類，兩者的種內(nèi)Bootstrap檢驗(yàn)可信度分別為98%和96%，種間Bootstrap檢驗(yàn)可信度為100%；金蠅屬包括14只大頭金蠅，種內(nèi)Bootstrap檢驗(yàn)可信度為99%。麻蠅科分出亞麻蠅屬和別麻蠅屬2支，屬間Bootstrap檢驗(yàn)可信度為94%。亞麻蠅屬包括4只肥須亞麻蠅，種內(nèi)Bootstrap檢驗(yàn)可信度為82%；別麻蠅屬包括4只棕尾別麻蠅，種內(nèi)Bootstrap檢驗(yàn)可信度為97%。各個(gè)科、屬、種間的劃分清晰，效果好。

2.5 種內(nèi)及種間進(jìn)化分歧

經(jīng)過(guò)對(duì)不同地區(qū)2科4屬5種53個(gè)蠅類個(gè)體的遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，獲得不同蠅種種間差異為0.007～0.045，種內(nèi)差異為0～0.001，種間差異和種內(nèi)差異沒有交叉（表3）。

圖2 基于53個(gè)樣本28S rRNA基因中715bp序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 53個(gè)樣本28S rRNA基因中715bp序列的種間差異和種內(nèi)差異

3 討 論

根據(jù)尸體上嗜尸性蠅類生態(tài)群落演替規(guī)律對(duì)死亡時(shí)間和死亡地點(diǎn)進(jìn)行推斷，首要任務(wù)就是鑒定其種類。盡管我國(guó)具有豐富經(jīng)驗(yàn)的昆蟲學(xué)專家能夠快速、精確地作出鑒定，但也僅限于成蟲，困難的是對(duì)蠅類卵、幼蟲、蛹生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的把握和形態(tài)學(xué)的鑒定，這對(duì)于缺乏昆蟲學(xué)專業(yè)知識(shí)的廣大法醫(yī)工作者來(lái)說(shuō)更是難上加難，因此尋找一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、迅速、通用的方法是當(dāng)務(wù)之急。1994年SPERLING等[9]首次將一種以DNA為基礎(chǔ)的方法用于嗜尸性昆蟲種類鑒定，此后DNA分子鑒定作為形態(tài)學(xué)鑒定方法的補(bǔ)充手段被越來(lái)越多的法醫(yī)昆蟲學(xué)研究者所接受。

28S rRNA基因是真核生物染色體上編碼核糖體大亞基的基因，具有重要的生物學(xué)功能，在進(jìn)化上比較保守，是研究生物系統(tǒng)發(fā)育較好的分子標(biāo)記。其序列中包含12個(gè)可變區(qū)，基因變異性較大，因此可用于嗜尸性蠅類從科到種水平上的分子鑒定。YUSSEFFVANEGAS等[2，7]應(yīng)用28S rRNA基因序列成功對(duì)麗蠅科屬種進(jìn)行鑒定，本研究結(jié)果與其一致。葛振萍等[10]用28S rRNA基因中698 bp序列片段作為分子標(biāo)記對(duì)常見有瓣蠅類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，取得了很好的效果。

本研究中，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。洛陽(yáng)地區(qū)的5種嗜尸性蠅類27條序列與來(lái)自GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)不同國(guó)家不同地區(qū)的26個(gè)相應(yīng)蠅種序列（表1）合并分析后發(fā)現(xiàn)，利用細(xì)胞核28S rRNA基因中715bp的基因序列可以有效地將洛陽(yáng)地區(qū)常見嗜尸性蠅類鑒定到種的水平。BLAST在線比對(duì)過(guò)程中沒有發(fā)現(xiàn)與棕尾別麻蠅一致的該基因序列，檢索GenBank棕尾別麻蠅28S rRNA序列，只發(fā)現(xiàn)4條長(zhǎng)度約400bp的短序列，說(shuō)明該蠅種的相關(guān)研究較少，而本研究的序列信息可以為此提供補(bǔ)充。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，絲光綠蠅與銅綠蠅分成明顯的兩支，可初步認(rèn)為該基因序列能夠?qū)τH緣關(guān)系非常近的絲光綠蠅與銅綠蠅進(jìn)行鑒別，這與WILLIAMS等[7，11]的研究結(jié)果一致。

根據(jù)WELLS等[12]的研究表明，判定一個(gè)遺傳標(biāo)記是否能夠進(jìn)行嗜尸性蠅類的分子鑒定，起決定作用的是種內(nèi)序列變異的百分比，且與種間序列變異百分比無(wú)重疊。聯(lián)合線粒體基因COⅠ和COⅡ進(jìn)行鑒定，種內(nèi)差異〈1%，種間差異≥3%，通過(guò)分子鑒定，即使不能夠準(zhǔn)確確定某一特定嗜尸性蠅種，至少可以把未知蠅種定位于某一特定的進(jìn)化分支上。本研究中，不同蠅種種間差異為0.007～0.045，種內(nèi)差異為0～0.001，與WELLS等的研究相比，種間差異未達(dá)到3%，但種間差異和種內(nèi)差異沒有交叉，所有樣本均位于某一特定的分支上，并且Bootstrap檢驗(yàn)可信度≥81%。與國(guó)內(nèi)研究[13-14]也有一些差異，這可能與樣本量大小、所捕獲的蠅種差異及分子標(biāo)記的選擇有關(guān)。鑒于本研究中兩種麻蠅的種間差異只有0.007，本實(shí)驗(yàn)又選擇了COⅠ基因序列中經(jīng)典DNA條形碼序列采用相同的實(shí)驗(yàn)和分析方法再次驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的種間差異為0.080，初步推測(cè)本研究中所選擇的28S rRNA基因序列對(duì)麻蠅的鑒別能力有限，這有待于增加樣本種類和數(shù)量進(jìn)一步研究。

本研究中采用蠅類樣本腿部提取DNA，簡(jiǎn)便易行，同時(shí)Chelex-100法是法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，更有利于在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣。盡管28S rRNA靶基因序列片段相對(duì)較長(zhǎng)，但對(duì)于目前的技術(shù)，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)足以完成。鑒于28S rRNA基因變異性大的特點(diǎn)，其對(duì)嗜尸性蠅類鑒定有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，本課題組將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選高變異的短片段用于嗜尸性蠅類分子鑒定的研究。

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