姜美玲 ，劉志杰 ，潘 靜 ，路 健 ，梁新華

（1.吉林鳴正司法鑒定中心，吉林 吉林 132011；2.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；3.赤峰市林西縣公安局，內(nèi)蒙古 赤峰 025250）

溺水是世界三大意外死亡原因之一，在發(fā)達(dá)國家，每10萬人中有0.6～1.2人死亡[1]。而水中尸體的死因判定是法醫(yī)學(xué)者公認(rèn)的難題之一，這是由于大部分溺死案件的特征性尸體檢驗(yàn)所見很少，從而難以與自殺、意外、他殺及自然死亡區(qū)別[2]。有研究[3]表明，約88個(gè)應(yīng)激相關(guān)炎癥因子可能有助于溺死的診斷，其中包括白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1α、IL-1β、IL-13 等。 本研究利用上述炎癥因子，并加入常見疾病心肌梗死作為對(duì)照，采用TaqMan探針法檢測(cè)大鼠肺組織及血清中 IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA 的表達(dá)變化，進(jìn)一步探究其作為溺死診斷指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠18只，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量150～200 g，隨機(jī)分為溺死組、空白對(duì)照組和心肌梗死組，每組6只。

1.1.2 模型制作及檢材提取

大鼠均籠養(yǎng)，室溫保持在20～25℃。溺死組大鼠投入水桶中，讓其自由游泳10 min左右適應(yīng)水中溫度，再將其頭部按入水中至溺死后撈出[4]?？瞻讓?duì)照組采用頸椎脫臼法處死。心肌梗死組應(yīng)用異丙腎上腺素25 mg/kg·d-1腹膜下注射，連續(xù)注射5 d，建立大鼠心肌梗死模型[5]，第6天頸椎脫臼法處死。

處死后各組大鼠均從右心室抽取靜脈血2～4mL，置于4℃冰箱中冷卻30min，之后以離心半徑10cm，1 000 r/min，離心5 min，收集血清，置于-80℃冰箱中備用。取血后，剪取右肺下葉5g，置于-80℃冰箱中備用。剪取各組大鼠心肌，10%多聚甲醛溶液固定后，制成石蠟切片，行HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.2 主要儀器與試劑

LightCycler?480 系統(tǒng)（瑞士 Roche 公司）、Centrifuge 5430R多功能微型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國eppendorf公司）。BIOG組織RNA提取試劑盒、BIOG血漿游離RNA提取試劑盒、一步法超級(jí)熒光定量PCR試劑盒（常州百代生物科技有限公司）。

1.3 IL-1α、IL-1β 及 IL-13 mRNA 的提取

肺組織IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA的提取按照BIOG組織RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作，血清IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA的提取參照BIOG血漿游離RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.4 引物、探針設(shè)計(jì)與合成

目的基因及內(nèi)參基因的引物、探針序列均來自于GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），并采用AlleleID 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)優(yōu)化，經(jīng)BLAST檢索確認(rèn)特異性，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物、探針序列見表1。

表1 目的基因及內(nèi)參基因的引物和探針序列

1.5 一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在LightCycler?480系統(tǒng)上采用TaqMan探針法進(jìn)行PCR。按照一步法超級(jí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，TaqMan 探針（10 μmol/L） 0.5 μL，模板 RNA 500 ng，無RNA酶的雙蒸水（瑞士Roche公司）加至20 μL。本實(shí)驗(yàn)中樣品和內(nèi)參基因檢測(cè)均重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄 15min；95℃預(yù)變性 10min；95℃變性 15s，60℃退火 30s，72℃延伸 1min，40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用2-△Ct法[6]進(jìn)行基因表達(dá)的相對(duì)定量計(jì)算。應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，各指標(biāo)多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 病理學(xué)所見

溺死組大鼠在溺死終末期均未見口鼻部流出泡沫。

肺：溺死組肺體積明顯增大，出血嚴(yán)重，肺緣鈍圓，擠壓肺組織可見氣管和肺切面有泡沫樣液體流出。心肌梗死組和空白對(duì)照組大鼠肺組織外觀正常，可見散在出血點(diǎn)。

心：心肌梗死組心肌細(xì)胞腫脹，部分心肌細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)空泡樣變性，核溶解消失，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。溺死組及空白對(duì)照組大鼠心肌無明顯異常。

2.2 肺組織 IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA 表達(dá)檢測(cè)

由表2可知：（1）與空白對(duì)照組比較，溺死組大鼠肺組織中IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；（2）與心肌梗死組比較，溺死組大鼠肺組織中上述指標(biāo)均無明顯改變（P〉0.05）；（3）與空白對(duì)照組比較，心肌梗死組大鼠肺組織中上述指標(biāo)表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。

2.3 右心室血清 IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA 表達(dá)檢測(cè)

由表2可知：（1）與空白對(duì)照組比較，溺死組大鼠右心室血清中 IL-1β、IL-13 mRNA 表達(dá)均升高（P〈0.05），IL-1α mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；（2）與心肌梗死組比較，溺死組大鼠右心室血清中IL-1β及IL-13 mRNA 表達(dá)均升高（P〈0.05），IL-1α mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；（3）與空白對(duì)照組比較，心肌梗死組大鼠右心室血清中IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。

表2 各組大鼠肺組織與右心室血清中IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（n=6，±s）

表2 各組大鼠肺組織與右心室血清中IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（n=6，±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P〈0.05；2）與心肌梗死組比較，P〈0.05

組別 組織 IL-1α IL-1β IL-13空白對(duì)照 肺 0.16±0.04 0.12±0.03 0.10±0.03血清 0.15±0.03 0.13±0.01 0.10±0.02心肌梗死 肺 0.15±0.01 0.12±0.01 0.09±0.01血清 0.13±0.02 0.15±0.03 0.09±0.03溺死 肺 0.18±0.04 0.12±0.03 0.09±0.02血清 0.15±0.02 0.19±0.051）2） 0.16±0.041）2）

3 討 論

溺死案件的大體解剖雖常具有特征性，但不具有特異性，需結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)等綜合分析。尸體解剖時(shí)肺組織可見水性肺氣腫改變，但這也不是溺死的特異性變化，在其他情況下也可發(fā)生，如充血性心力衰竭、麻醉藥物過量或者隨后的長(zhǎng)期復(fù)蘇等[7]。但溺水的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著獨(dú)特且復(fù)雜多樣的應(yīng)激反應(yīng)，因應(yīng)激時(shí)間不同，其應(yīng)激反應(yīng)所涉及的相關(guān)基因表達(dá)也不盡相同。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械性窒息、溺死以及火災(zāi)中死亡的尸體肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)A（pulmonary surfactant-associated protein A，SP-A）mRNA表達(dá)下調(diào)，這與急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者肺組織中 SP-A的表達(dá)變化一致，認(rèn)為溺水死亡的過程中可能伴隨著早期的ARDS。此外，該實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)溺水激活了炎癥反應(yīng)，肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表達(dá)升高，而這些炎癥因子在急性肺損傷或ARDS中亦發(fā)揮著重要的作用。

IL-1α與IL-1β同屬于IL-1家族，兩者通過共同的IL-1受體傳遞信號(hào)通路，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）可以阻斷該信號(hào)通路[9]。IL-1作為一類復(fù)雜的多功能細(xì)胞因子，廣泛參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，從而對(duì)機(jī)體各種類型的細(xì)胞均能發(fā)揮調(diào)控作用[10]。IL-13是一種天然抗炎癥細(xì)胞因子，包括抑制單核細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖及分化，促進(jìn)IgE生成。IL-13還可以增加IL-1Ra的生成，并且減弱白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，進(jìn)而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用[11]。

與空白對(duì)照組和心肌梗死組比較，IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA在溺水組大鼠肺組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能不能鑒別診斷生前溺死。PARSONS等[12]研究認(rèn)為，血漿中一些炎癥因子的升高，提示肺損傷的程度及預(yù)后情況。本實(shí)驗(yàn)?zāi)缢来笫笱逯蠭L-1β和IL-13 mRNA表達(dá)上調(diào)，有可能預(yù)示著溺水大鼠肺損傷的嚴(yán)重程度。通過檢測(cè)血清中IL-1β、IL-13 mRNA，有望為生前溺水與死后拋尸入水的鑒別提供依據(jù)。

致謝：

感謝導(dǎo)師任廣睦老師在我研究生期間對(duì)我的悉心點(diǎn)撥及照顧。任老師無論在理論上還是實(shí)踐中，都給予我很大的幫助。在此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x！

[1]HOOPER A J，HOCKINGS L E.Drowning and immersion injury[J].Anaesthesia&Intensive Care Medicine，2011，12（9）：399-402.

[2]汪家文，于曉軍，王曉雁.溺死法醫(yī)學(xué)鑒定的研究新進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（4）：276-279.

[3]尹長(zhǎng)玉.不同溺死類型大鼠肺組織中應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)水平研究[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)，2015.

[4]馬艷艷，劉昕，李玉湘.溺水大鼠動(dòng)物模型的建立及觀察[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，43（2）：359-362.

[5]閆位娟，李貽奎，高會(huì)麗，等.心肌梗死模型研究進(jìn)展[J].赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012（11）：144-146.

[6]李康.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：235.

[7]LIU Z，ZHANG B，WANG X B，et al.Hypertonicity contributes to seawater aspiration-induced lung injury：Role of hypoxia-inducible factor 1α[J].Exp Lung Res，2015，41（6）：301-315.

[8]MIYAZATO T， ISHIKAWA T， MICHIUE T， et al.Molecularpathology ofpulmonary surfactantsand cytokines in drowning compared with other asphyxiation and fatal hypothermia[J].Int J Legal Med，2012，126（4）：581-587.

[9]GALANI V，TATSAKI E，BAI M，et al.The role of apoptosis in the pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome （ARDS）： an up-to-date cellspecific review[J].Pathol Res Pract，2010，206（3）：145-150.

[10]DI PAOLO N C，SHAYAKHMETOV D M.Interleukin 1α and the inflammatory process[J].Nat Immunol，2016，17（8）：906-913.

[11]張宏偉，潘靈輝.急性肺損傷與細(xì)胞因子平衡的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2006，12（23）：1411-1414.

[12]PARSONS P E，MATTHAY M A，WARE L B，et al.Elevated plasma levels of soluble TNF receptors are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288（3）：L426-L431.