梁成宵，古瑞，李婷，楊冠，吳東葉，屈琳林，李鳳君，田伏洲，孫紅玉

終末期肝病包括急性肝衰竭、肝硬化和肝癌等，病情兇險、病死率高，嚴(yán)重危害著人們的身體健康。肝移植是目前治療終末期肝病唯一有效的方法，但供體器官短缺、免疫抑制以及繼發(fā)感染等問題限制了其在臨床的應(yīng)用[1-2]。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷進步，干細胞移植技術(shù)在各種終末期肝病的治療中取得了令人鼓舞的進展[3-4]，但研究顯示其療效欠佳，這是由于肝臟病變部位處于相對惡劣的微環(huán)境，如缺血性缺氧、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等，均會影響干細胞的黏附與存活[5]。因此，臨床上亟待尋找新的策略來提高干細胞修復(fù)肝病的療效。

可注射水凝膠作為一種新穎的工具，可用于干細胞或藥物遞送，受到再生醫(yī)學(xué)研究者的極大關(guān)注[6]?？勺⑸湫运z種類繁多，常見的有膠原、MatrigelTM、殼聚糖、纖維蛋白等。最近有研究表明，基于天然細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)材料的組織工程研究有望為組織損傷修復(fù)提供一種新的策略[7-9]。ECM脫細胞支架材料是指通過物理、化學(xué)和生物學(xué)方法將器官組織的細胞成分全部清除，從而完整地保留血管系統(tǒng)、超微結(jié)構(gòu)以及主要細胞外基質(zhì)成分[10]，能夠提供最天然的細胞外微環(huán)境，已成為組織再生領(lǐng)域有應(yīng)用前景的支架材料。特別是ECM水凝膠材料，可通過微創(chuàng)注射的方法將材料或細胞遞送到組織損傷部位，具有微創(chuàng)、安全、可控性強等優(yōu)點，大大增強了脫細胞基質(zhì)材料在臨床上的應(yīng)用[11-12]。國際上已將ECM水凝膠應(yīng)用于心臟、軟骨和皮膚的組織再生領(lǐng)域，研究表明其對組織的修復(fù)與重建均發(fā)揮了有益作用[13-17]。然而，針對肝臟ECM水凝膠材料的研究相對較少，特別是尚未見有關(guān)其生物相容性的報道?；诖耍狙芯吭谥苽涓闻K脫細胞基質(zhì)的基礎(chǔ)上，研制與表征肝臟相似的ECM水凝膠材料，并系統(tǒng)評價其對BRL-3A 的細胞活力、增殖情況及黏附作用的影響，以期為后續(xù)肝臟ECM水凝膠的體內(nèi)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠(體重200～220g)購自成都達碩實驗動物有限公司；大鼠正常肝細胞系BRL-3A 細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。十二烷基磺酸鈉(sodium dedecyl sulfate，SDS；美國Amresco)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100，美國Sigma)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin，美國Sigma)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國Sigma)，胃蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibeo)，HE(北京索萊寶科技有限公司)，AlamarBlue試劑、Live/Dead活性/細胞毒性試劑盒(美國Thermo)。

1.2 主要儀器 掃描電鏡(日本，日本電子)，倒置相差熒光顯微鏡 (日本Olympus，IX81)，CO2培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo)，分光光度計(屹譜儀器制造上海有限公司)，雙道微量注射泵(浙江浙大醫(yī)療設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀(美國BioRad)，冷凍干燥機(美國Virtis)。

1.3 肝臟脫細胞基質(zhì)的制備 參照文獻[18]報道的方法對肝臟進行脫細胞處理。其制備方法簡述如下：分離完好的肝臟，1% SDS灌注2h，0.01mol/L PBS溶液沖洗15min，1% Triton X-100灌注30min，0.01mol/L PBS溶液沖洗3h。將洗脫好的肝臟，冷凍干燥，分裝密封，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.4 ECM水凝膠的制備 在無菌條件下將肝臟脫細胞基質(zhì)剪碎，按照10mg/ml比例加入鹽酸-胃蛋白酶溶液中，室溫緩慢攪拌至溶解狀態(tài)，調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后將該溶液置于37℃，觀察其成膠時間。

1.5 表面形貌表征 將凍干的ECM水凝膠樣品在液氮中冷凍，然后將其淬斷形成新鮮界面，界面噴金后，在掃描電鏡下觀察樣本表面形貌結(jié)構(gòu)。

1.6 細胞種植 將ECM水凝膠制備成24孔板大小，放入24孔板中，紫外燈滅菌2h后，用無菌生理鹽水清洗2次；將BRL-3A 細胞以8000個/孔的密度接種于ECM水凝膠上，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時設(shè)置空白培養(yǎng)板作為對照組；最后將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。

1.7 細胞活力檢測 采用Live/Dead活性/細胞毒性試劑盒檢測BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的成活情況，以空白培養(yǎng)板作為對照組。在培養(yǎng)1d和3d時，按照試劑盒說明書加入相關(guān)試劑，染色后熒光顯微鏡下隨機選擇10個視野觀察，利用Image J 軟件計算水凝膠組與對照組活細胞和死亡細胞的數(shù)目，進行統(tǒng)計分析。細胞活力計算公式為：細胞活力=活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。

1.8 細胞增殖情況檢測 采用AlamarBlue 法檢測ECM水凝膠對BRL-3A細胞增殖的影響，以空白培養(yǎng)板作為對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。在指定時間點添加AlamarBlue試劑孵育后，采用酶標(biāo)儀(波長為 570nm和610nm)檢測水凝膠組和對照組的吸光度(OD)值，記錄數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。

1.9 細胞黏附檢測 培養(yǎng)1d后，通過細胞骨架染色觀察BRL-3A細胞的黏附情況(水凝膠組)，以空白培養(yǎng)板作為對照組。具體方法如下：每孔用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗3次，每次5min；然后每孔加入濃度為5mg/L的FITCPhalloidin溶液，避光孵育10min；PBS洗3次，每次5min；最后加入濃度為5mg/L的DAPI溶液，避光孵育5min；PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.10 病理學(xué)觀察 肝臟脫細胞基質(zhì)經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片等步驟制備為石蠟切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本的組織形態(tài)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料在滿足正態(tài)性的基礎(chǔ)上以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟脫細胞基質(zhì)鑒定 HE染色可見肝臟脫細胞基質(zhì)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，無藍染胞核物質(zhì)(圖1A)；DNA含量測定結(jié)果顯示脫細胞基質(zhì)中DNA含量明顯低于正常肝臟組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B，P＜0.001)，進一步證細胞已經(jīng)完全被洗脫掉，獲得了理想的肝臟脫細胞基質(zhì)材料。

2.2 ECM水凝膠的大體觀察與內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu) 脫細胞基質(zhì)經(jīng)鹽酸-胃蛋白酶溶液溶解后在常溫下呈現(xiàn)液態(tài)(圖2A)，但當(dāng)置于37℃ 10～15min后，凝結(jié)為固態(tài)(圖2B)。掃描電鏡檢測顯示ECM水凝膠呈現(xiàn)為多孔狀結(jié)構(gòu)，不同粗細的ECM纖維呈網(wǎng)狀分布(圖2C)。

2.3 細胞毒性研究 經(jīng)Live/Dead染色試劑盒檢測BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的存活情況，由圖3A可見，培養(yǎng)1d和3d后，與對照組比較，水凝膠組綠色熒光細胞(即活細胞)較多，紅色熒光細胞(即死細胞)較少。統(tǒng)計結(jié)果表明，水凝膠組細胞活力略高于對照組(圖3B)，提示本實驗制備的肝臟ECM水凝膠有利于細胞生長。

圖1 肝臟脫基質(zhì)的鑒定Fig. 1 Identification of acellular matrix for liver tissue

圖2 ECM水凝膠大體觀察及表面形貌Fig. 2 General observation and surface characterization of ECM hydrogel

圖3 細胞毒性實驗結(jié)果Fig. 3 Results of cytotoxicity test

2.4 細胞增殖情況檢測結(jié)果 采用AlamarBlue法評估BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的增殖情況，結(jié)果可見，培養(yǎng)1d和3d后，水凝膠組細胞的吸光度值顯著高于對照組(P＜0.05，圖4)。

2.5 細胞黏附檢測結(jié)果 通過FITC-Phalloidin染色細胞骨架(圖5A)，在免疫熒光顯微鏡下觀察BRL-3A細胞在ECM水凝膠及空白培養(yǎng)板上培養(yǎng)1d后的黏附情況，結(jié)果顯示細胞在水凝膠表面呈梭形生長，細胞生長狀態(tài)明顯好于對照組，統(tǒng)計結(jié)果顯示每個視野下水凝膠組黏附的細胞數(shù)量(84±8個)顯著高于空白對照組(53±7個，P＜0.05)。

圖4 AlamarBlue法評估BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的增殖情況Fig. 4 Proliferation of BRL-3A cells in ECM hydrogel detected by AlamarBlue method

圖5 兩組細胞黏附情況Fig. 5 Cell adhesion of the two groups

3 討 論

近年來，可注射水凝膠在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到研究者的極大關(guān)注[4]，特別是脫細胞基質(zhì)水凝膠材料，不但具備低免疫原性，含有豐富的生物活性成分，能為細胞提供更接近于天然組織的微環(huán)境，而且可微創(chuàng)注射于組織損傷部位，具有獨特的臨床應(yīng)用價值[11-12]。因此，國際上掀起了基于可注射性ECM水凝膠材料研究的熱潮，結(jié)果顯示其在心肌、軟骨和皮膚組織損傷修復(fù)中均可發(fā)揮有益的促進作用[14,16-17]。然而，目前有關(guān)肝臟ECM水凝膠的研究鮮見。因此本研究制備了肝臟ECM水凝膠，并系統(tǒng)評價其對肝細胞生長、黏附和增殖的影響。

脫細胞基質(zhì)是運用化學(xué)、酶解或機械等方法去除組織器官中的細胞成分，而保存細胞外基質(zhì)成分的一種技術(shù)[10]。本實驗對大鼠肝臟進行脫細胞處理，獲得肝臟脫細胞基質(zhì)材料，HE染色觀察可見脫細胞基質(zhì)為紅色網(wǎng)狀，未見細胞殘留，證實獲得了理想的脫細胞基質(zhì)材料，與文獻報道的一致[18]。肝臟脫細胞基質(zhì)經(jīng)溶解后制備成水凝膠，掃描電鏡觀察可見其呈交錯排列的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，表明肝臟ECM水凝膠具有細胞附著增殖的充足空間，具備成為可注射支架材料的良好條件。

生物相容性是評估組織工程支架材料的重要指標(biāo)，也是支架材料臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。其中，體外細胞毒性評價是生物相容性評價的最基本指標(biāo)之一。本實驗采用Live/Dead染色、AlamarBlue法和細胞骨架染色對肝臟基質(zhì)水凝膠的生物相容性進行了評價。Live/Dead細胞毒性檢測顯示，水凝膠組細胞活力略高于對照組，表明制備的肝臟ECM水凝膠有利于細胞的生長。此外，AlamarBlue法和鬼筆環(huán)肽染色檢測結(jié)果分別提示ECM水凝膠促進了肝細胞的增殖和黏附能力，這與心臟組織來源制備的水凝膠相似[13]。上述結(jié)果表明ECM水凝膠材料具有良好的細胞相容性。分析可能原因如下：其一，ECM水凝膠具有親水性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于細胞黏附于其表面；其二，ECM水凝膠含有細胞外基質(zhì)的多種生物活性分子，可為體外生長的細胞提供與體內(nèi)相似的微環(huán)境，有利于細胞的黏附和生長。本課題組后續(xù)將針對ECM水凝膠在體內(nèi)的生物相容性進行深入研究。

綜上所述，本研究成功制備了網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的肝臟基質(zhì)水凝膠，該水凝膠有利于肝細胞生長，并可促進肝細胞的黏附和增殖。本研究制備的肝臟基質(zhì)水凝膠生物相容性良好，有望作為可注射性水凝膠材料在終末期肝病的治療中發(fā)揮作用。

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