盧勁曄，趙懷寶，顧蓓蓓，馮 晴，張 磊，許 君，沈贊明*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；3.連云港東海縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 連云港 222300）

反芻動(dòng)物的胃是復(fù)胃，由4個(gè)胃室組成，分別是瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃。其中，瘤胃與瓣胃為反芻動(dòng)物主要的消化吸收?qǐng)鏊?。日糧添加精料比率對(duì)反芻動(dòng)物前胃的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要的作用。在山羊與牛的研究中發(fā)現(xiàn)，與單純飼喂粗料日糧相比，添加精料飼喂可以提高瘤胃重量，促進(jìn)瘤胃乳頭發(fā)育，增大瘤胃乳頭橫切面積[1-3]。大多數(shù)研究主要集中在瘤胃，研究表明高精料日糧提高瘤胃VFA含量，促進(jìn)瘤胃上皮生長(zhǎng)發(fā)育。然而，關(guān)于日糧營(yíng)養(yǎng)對(duì)瓣胃生長(zhǎng)影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，提高精料飼喂比率后，瘤胃重量提高，而瓣胃重量下降[4]。本試驗(yàn)擬進(jìn)一步探索不同精粗比日糧引起山羊瘤胃、瓣胃上皮生長(zhǎng)差異的機(jī)理。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)

本試驗(yàn)動(dòng)物選用健康的青年波雜山羊（90～120日齡）16只。試驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)2周時(shí)間，期間對(duì)山羊進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)，山羊自由采食及飲水，逐漸增加精料飼喂量至400 g·d-1。試驗(yàn)開(kāi)始后，根據(jù)體重相近及公母對(duì)半原則，隨機(jī)分為粗料組（PS組，n=8）和粗料+精料組（PSC組，n=8）。試驗(yàn)期間自由飲水及采食花生桿；PSC組每天飼喂精料400 g，飼喂持續(xù)42 d，第43天屠宰取樣，日糧營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧營(yíng)養(yǎng)水平 DM

1.2 樣品采集

山羊屠宰后取瘤胃、瓣胃上皮，用預(yù)冷的PBS（pH 7.4）反復(fù)沖洗，再用吸水紙擦干，部分樣品用10%福爾馬林溶液固定，部分樣品置于液氮保存。

1.3 上皮組織形態(tài)學(xué)觀察

1.3.1 上皮組織切片制作

采用石蠟切片法觀察瘤胃與瓣胃上皮組織形態(tài)。10%福爾馬林溶液固定24 h后，采用梯度酒精脫水，再將組織投入二甲苯中透明10～15 min，60℃石蠟包埋。冷卻后的蠟塊經(jīng)修塊后再用切片機(jī)切片，切片厚度5 μm。采用H.E染色法染色。

1.3.2 上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

每只山羊的瘤胃及瓣胃樣品均取3個(gè)蠟塊，每個(gè)蠟塊精選3張非連續(xù)切片，每張切片分別讀取3個(gè)不同區(qū)域，再取平均值。采用Image-Pro Plus 8.0分析系統(tǒng)讀數(shù)上皮細(xì)胞層數(shù)。

1.4 上皮細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)

1.4.1 上皮細(xì)胞的分離與固定

取出山羊瘤胃及瓣胃上皮組織，清洗干凈后，剪取組織塊（約500 mg）置于燒杯中，D-Hanks溶液漂洗3～4次；再加入胰酶37℃水浴消化；30 min后棄去上清液，再取出上皮組織。重復(fù)上述消化步驟3～4次。將處理后的上皮組織置于另1個(gè)干凈燒杯中，繼續(xù)加入胰酶消化10～15 min，顯微鏡鏡下觀察所得細(xì)胞大部分為圓形時(shí)進(jìn)行收集，收集液中加入1滴小牛血清以終止消化。收集液1 500 r·min-1離心10 min后得細(xì)胞沉淀，再用PBS洗滌細(xì)胞沉淀，加入2 mL預(yù)冷的75%酒精重懸細(xì)胞，混勻后4℃保存待測(cè)。

1.4.2 碘化丙啶染色與流式細(xì)胞分析

將75%酒精固定的上皮細(xì)胞1 500 r·min-1離心10 min。細(xì)胞沉淀用PBS 50 μL重懸，再加入碘化丙啶染液500 μL，震蕩混勻后置于室溫避光染色20 min，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000～12 000個(gè)細(xì)胞，用ModFit軟件分析結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 山羊瘤胃與瓣胃重量

山羊瘤胃與瓣胃重量見(jiàn)表2。

由表2可知，PSC組山羊瘤胃干重顯著高于PS組（P＜0.05）；相反，PSC組瓣胃干重顯著低于PS組（P＜0.05）。結(jié)果表明添加精料飼喂促進(jìn)山羊瘤胃生長(zhǎng)，卻抑制瓣胃生長(zhǎng)。

表2 不同精粗比日糧對(duì)山羊瘤胃、瓣胃重量的影響

2.2 瘤胃與瓣胃組織形態(tài)學(xué)觀察

瘤胃上皮組織形態(tài)學(xué)變化如圖1所示。從黏膜面向漿膜面分為角質(zhì)層（SC）、顆粒層（SG）、棘突層（SS）和基底層（SB）。角質(zhì)層由多層角質(zhì)化細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞核及細(xì)胞器完全退化，細(xì)胞染色較深；顆粒層細(xì)胞細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈橢圓形，染色較淺；棘突層細(xì)胞較大，細(xì)胞核呈圓形；基底層又稱為生發(fā)層，由1～2層立方形細(xì)胞排列而成，細(xì)胞體積較小，排列整齊，細(xì)胞核染色較深。瓣胃上皮細(xì)胞組成及形態(tài)與瘤胃相似，見(jiàn)圖2。

2.3 瘤胃與瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)

日糧粗精比例對(duì)山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)的影響見(jiàn)表3。

由表3可知，與PS組相比，PSC組山羊瘤胃上皮顆粒層和棘突層細(xì)胞總層數(shù)顯著升高，而PSC組瓣胃上皮顆粒層和棘突層細(xì)胞總層數(shù)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，添加精料飼喂促進(jìn)增加瘤胃上皮細(xì)胞層數(shù)，卻減少瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)。

2.4 瘤胃與瓣胃上皮細(xì)胞周期

日糧粗精比例對(duì)山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響見(jiàn)表4。

由表4可知，PSC組山羊瘤胃上皮細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著高于PS組（P＜0.05）；而PSC組山羊瓣胃上皮細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著低于PS組（P＜0.05）。結(jié)果表明，添加精料飼喂加速瘤胃上皮細(xì)胞周期G1期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而添加精料比率卻抑制瓣胃增殖。

圖1 瘤胃上皮乳頭切片

圖2 瓣胃上皮組織切片

表3 日糧粗精比例對(duì)山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞層數(shù)的影響

表4 日糧粗/精比例對(duì)山羊瘤胃、瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響 %

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)日糧添加精料加速瘤胃上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。早在20世紀(jì)50年代，就有研究報(bào)道了日糧添加精料增大犢牛瘤胃體積，促進(jìn)瘤胃乳頭發(fā)育[5]。后續(xù)研究表明日糧添加精料促進(jìn)青年奶牛瘤胃乳頭生長(zhǎng)，此結(jié)果是由飼料的高能量水平而并非飼料物理性狀引起的[6]。但這些試驗(yàn)僅限于高能量日糧促進(jìn)瘤胃上皮乳頭增大的表觀指標(biāo)，而不清楚其機(jī)理。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加精料促進(jìn)瘤胃上皮生長(zhǎng)是通過(guò)縮短瘤胃上皮細(xì)胞周期進(jìn)程，減速細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)中，瓣胃上皮結(jié)果與瘤胃相反，純粗料日糧加速瓣胃上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)瓣胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。此結(jié)果與在鼠結(jié)腸的一項(xiàng)研究結(jié)果類(lèi)似，日糧添加纖維素比率可以降低降低G0/G1期細(xì)胞比率、提高S期細(xì)胞比率，促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。不同精粗比率日糧對(duì)瘤胃、瓣胃上皮生長(zhǎng)的差異性可能與瘤胃、瓣胃結(jié)構(gòu)及功能的差異相關(guān)。

瘤胃中日糧的消化主要由微生物完成，瘤胃內(nèi)微生物將食物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸后被瘤胃上皮吸收；瓣胃的主要表現(xiàn)為“篩網(wǎng)”作用，通過(guò)瓣胃肌肉的劇烈收縮將大顆粒食物研磨成細(xì)小的顆粒；因而瓣胃上皮的發(fā)育可能對(duì)進(jìn)入瓣胃食物的物理性狀依賴性較強(qiáng)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究加以證明。

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