陳坤，徐曉楠，彭靖，馮小杰，李亞朋，戰(zhàn)秀梅，韓曉日

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生物炭及炭基肥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

陳坤，徐曉楠，彭靖，馮小杰，李亞朋，戰(zhàn)秀梅，韓曉日

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院/土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110866）

【目的】微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起到轉(zhuǎn)換者的作用。論文以傳統(tǒng)有機(jī)肥（玉米秸稈和豬廄肥）為對(duì)照，探究施用生物炭和炭基肥等新型有機(jī)物料培肥改土對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為不同有機(jī)物料合理施用提供理論參考。 【方法】 依托沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤改土定位試驗(yàn)平臺(tái)（始于2009年），利用磷脂脂肪酸（PLFA）技術(shù)研究長(zhǎng)期不同有機(jī)無(wú)機(jī)配施條件下土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)特征及二者的相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)處理包括：秸稈配施化肥還田（CS）、豬廄肥配施化肥（PMC）、炭基肥（BF）以及生物炭配施化肥（BIO）?！窘Y(jié)果】PMC和BF處理的pH顯著高于BIO處理；PMC處理的全氮含量顯著高于BF和CS處理，BIO與PMC處理沒有顯著差異；PMC處理的有機(jī)質(zhì)含量顯著高于BF和BIO處理；PMC處理的土壤含水量最高；不同處理間土壤全鉀含量沒有顯著差異。PMC處理的土壤微生物總PLFAs含量最高，其他處理間沒有差異；PMC處理的細(xì)菌PLFAs含量最高，BF處理的細(xì)菌PLFAs含量顯著低于BIO和CS處理；PMC處理的真菌、革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌PLFAs含量顯著高于BIO處理，BF與PMC處理差異不顯著；PMC處理的放線菌含量顯著高于CS處理，BF和BIO處理居于中間無(wú)顯著差異。BF處理的Shannon-Winner多樣性指數(shù)和真菌/細(xì)菌比值顯著高于BIO處理，BF和PMC處理的革蘭氏陽(yáng)性/陰性細(xì)菌比值顯著低于BIO處理。冗余分析（RDA）結(jié)果顯示，土壤pH、全氮和有機(jī)質(zhì)對(duì)土壤微生物各PLFA有極顯著影響（<0.01），含水量和全鉀有顯著影響（<0.05）。【結(jié)論】生物炭和炭基肥長(zhǎng)期施用明顯改善了土壤理化性質(zhì)；相較豬廄肥，施用生物炭不利于真菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的積累，而且施用生物炭和炭基肥對(duì)土壤微生物群落的影響不同，施用生物炭有利于細(xì)菌群落的繁殖，施用炭基肥有利于土壤真菌/細(xì)菌比和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的提高；土壤pH、全氮、有機(jī)質(zhì)、含水量和全鉀依次是影響土壤微生物群落的重要因子。

生物炭；炭基肥；磷脂脂肪酸；群落結(jié)構(gòu)；土壤微生物

0 引言

【研究意義】土壤微生物是土壤中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)不可或缺的參與者[1]，也是土壤養(yǎng)分的“源”和“匯”，支撐著土壤肥力，對(duì)環(huán)境變化極為敏感，土壤中的微小變動(dòng)都會(huì)引起其活性的變化[2]。生物炭（Biochar）是由農(nóng)林廢棄物等在缺氧環(huán)境下加熱裂解制成的一種穩(wěn)定有機(jī)物，可作為富碳土壤改良劑[3]。生物炭基肥料（炭基肥）是由生物炭與普通化學(xué)肥料復(fù)合而成的緩釋肥料[3-5]。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）標(biāo)記方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，技術(shù)成熟，可以有效測(cè)定土壤不同微生物群落生物量[6-7]。通過研究生物炭和炭基肥定位施用后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來(lái)判斷不同有機(jī)物料改良土壤效果，可以為農(nóng)田土壤培肥提供生態(tài)學(xué)方面的理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物炭在制備過程中形成了多孔隙、大比表面積的結(jié)構(gòu)，且具有高含碳量、多芳香烴、多極性官能團(tuán)的組成[3]，理化性質(zhì)穩(wěn)定[3,8]，使其成為優(yōu)良的土壤改良劑[9]。相關(guān)研究[4, 10-11]表明，生物炭施入土壤后提高了土壤含水量、pH、孔隙度、CEC以及養(yǎng)分水平，基于其本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也能為微生物提供適宜生存的微環(huán)境，對(duì)不同微生物群落產(chǎn)生影響[12]。細(xì)菌能夠吸附到生物炭的表面而不易被淋洗[13]，且生物炭的吸附作用取決于其孔隙的大小[14]。生物炭的微孔結(jié)構(gòu)能為真菌提供“避難”場(chǎng)所，可以避免物種內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)[15]。生物炭疏松多孔的結(jié)構(gòu)特征，可如海綿一樣保持與空氣和水分的共通性，RONDON發(fā)現(xiàn)經(jīng)生物炭處理的退化土壤固氮細(xì)菌能有效吸收來(lái)自大氣的氮素[16]，原因是通過提高土壤通氣性，增大氧分壓來(lái)刺激氮細(xì)菌的活性[17]。生物炭本身富含多種養(yǎng)分，特別是易被微生物利用的碳源和氮源，有利于微生物尤其是細(xì)菌的活動(dòng)[18]。O'NEILL利用同位素示蹤法標(biāo)記氨基酸和核苷酸，檢測(cè)到添加生物炭后細(xì)菌活性和土壤呼吸速率增強(qiáng)，說(shuō)明施用生物炭能夠提高細(xì)菌對(duì)土壤碳的利用率[19]。研究還發(fā)現(xiàn)，生物炭的施用量[3]，也會(huì)對(duì)土壤微生物的群落多樣性產(chǎn)生影響。【本研究切入點(diǎn)】沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營(yíng)養(yǎng)與施肥研究室于2009年春天布置生物炭及炭基肥棕壤改土定位試驗(yàn)，觀測(cè)長(zhǎng)期施用條件下的培肥效果，同時(shí)以傳統(tǒng)的培肥改土措施——玉米秸稈還田和豬廄肥為對(duì)照，對(duì)比研究不同有機(jī)物料連續(xù)多年施用培肥改土的特征及優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)的前期研究結(jié)果表明，生物炭和炭基肥等各有機(jī)物料處理均改善了土壤理化性質(zhì)[4]，增加了土壤總有機(jī)碳和活性有機(jī)碳各組分碳含量，對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生了一定影響[21]。土壤有機(jī)碳和土壤酶的變化與土壤微生物的群落活性息息相關(guān)[1]，同時(shí)土壤微生物活性的變化與土壤養(yǎng)分的變異有關(guān)[20]，因此生物炭和炭基肥長(zhǎng)期施用是否改變了土壤微生物群落值得探索。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究探討生物炭和炭基肥連續(xù)施用7年后的土壤理化性質(zhì)變化和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征及二者的相關(guān)關(guān)系，以期揭示生物炭培肥改土的生物學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)和材料

田間微區(qū)試驗(yàn)于2009年5月開始，布置在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系土壤肥料長(zhǎng)期定位試驗(yàn)基地（41°83′N，123°56′E）。試驗(yàn)區(qū)屬溫帶濕潤(rùn)-半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年均溫度7.0—8.1℃，無(wú)霜期為147—164 d，年均降雨量574—684 mm。供試土壤屬第四紀(jì)黃土母質(zhì)發(fā)育的簡(jiǎn)育濕潤(rùn)淋溶土典型棕壤。2008年布置試驗(yàn)前土壤基本理化性質(zhì)如下：土壤有機(jī)質(zhì)1.53 g·kg-1，土壤全氮0.86 g·kg-1，土壤全磷0.42 g·kg-1，土壤全鉀20.40 g·kg-1，堿解氮51.30 mg·kg-1，有效磷4.60 mg·kg-1，速效鉀114.50 mg·kg-1，pH 5.5（水土比5﹕1）。土壤以2﹕1型黏粒礦物為主，主要是水云母（Hydrous mica），1﹕1型高嶺石（Kaolinte）含量次之，蒙脫石（Montmorillonite）含量最低，CEC為8.32 cmol·kg-1。土壤質(zhì)地：砂粒含量510 g·kg-1，粉粒含量280 g·kg-1，黏粒（＜2 μm）含量210 g·kg-1，土質(zhì)較黏。供試作物為花生，品種為阜花12。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)處理之間為相互對(duì)照，分為傳統(tǒng)有機(jī)物料（玉米秸稈和豬廄肥）培肥改土處理和新型有機(jī)物料（生物炭顆粒和炭基肥）培肥改土處理。處理1：玉米秸稈（CS）4 500 kg·hm-2+ NPK；處理2：豬廄肥（PMC）4 000 kg·hm-2+ NPK；處理3：炭基肥（BF）750 kg·hm-2（養(yǎng)分含量11-11-13）和處理4：生物炭顆粒（BIO）1 500 kg·hm-2+ NPK。設(shè)計(jì)處理1—4等養(yǎng)分（全量NPK），由于秸稈（CS）、豬廄肥（PMC）和生物炭顆粒（BIO）等有機(jī)物料本身養(yǎng)分含量低，以化肥（肥種類為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀）配施，使所有處理全量NPK養(yǎng)分相等，與炭基肥（BF）處理施用養(yǎng)分含量一致。表1為2015年各有機(jī)物料養(yǎng)分含量；生物炭顆粒為玉米芯450℃裂解，過篩添加膠結(jié)劑造粒，出炭率3﹕1；秸稈粉碎至2—3 cm，豬廄肥當(dāng)年腐熟。每年5月初春播前將全部肥料當(dāng)基肥施用，與土壤耕層混合后備壟，9月底收獲后移除全部植株。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，微區(qū)面積2 m2，微區(qū)間20 cm水泥埂分隔，微區(qū)內(nèi)花生采用大壟雙行種植，每池種植30穴。

表1 各有機(jī)物料干基養(yǎng)分（%）和pH

有機(jī)物料的養(yǎng)分含量為2015年的測(cè)定值 The nutrient of resources was measured in 2015

CS: Corn straw-returning; PMC: Piggery manure compost; BF: Biochar-based compound fertilizer; BIO: Biochar. 下同The same as below

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 采集處理土樣 2015年花生收獲期（9月28日）采集微區(qū)0—20 cm土層土樣，混合均勻后分兩份，一份風(fēng)干后用于土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定。另一份放入-80℃冰箱冷藏保存，用于冷凍干燥提取活體微生細(xì)胞膜脂肪酸。

1.3.2 基本理化性質(zhì)測(cè)定 土壤含水量（MC）測(cè)定采用恒溫箱烘干法；土壤全氮（TN）測(cè)定采用Dumas干燒法（德國(guó)VarioEL–Ⅲ型元素分析儀）；土壤有機(jī)碳（SOC）測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法；土壤全鉀（TK）測(cè)定采用氫氧化鈉熔融-火焰光度計(jì)比色法（Sherwood M410火焰光度計(jì)）；pH采用電極法按土水比1﹕5測(cè)定（雷磁PHS-3G）。

1.3.3 PLFA提取與測(cè)定

（1）PLFA的提取采用BOSSIO等[22]的方法，測(cè)定采用MIDI公司MIS系統(tǒng)鑒定。具體分為以下幾步。

①浸提 稱取4.000 g凍干土樣于聚四氟乙烯離心管中，加入15.2 mL混合浸提液（加液順序依次為：3.2 mL檸檬酸緩沖液，4.0 mL氯仿，8.0 mL甲醇）。25℃避光振蕩2.5 h，4 000 r/min離心10 min后上清液轉(zhuǎn)移到提前加入8.0 mL氯仿和8.0 mL檸檬酸緩沖液的玻璃試管中，重復(fù)上述步驟一次并轉(zhuǎn)移上清液，最終使氯仿﹕甲醇﹕檸檬酸緩沖液體積比=1﹕1﹕0.9。振蕩試管1 min并定時(shí)放氣。提取液避光靜置過夜待分層。

②分離 用玻璃吸管吸取分層后的上層水溶性液體（一樣一只吸管，不要吸到下層氯仿）。試管于通風(fēng)櫥內(nèi)避光條件通入純N2吹干氯仿層（保證整個(gè)過程試管充滿N2）。濃縮后的脂肪酸用5 mL氯仿分5次轉(zhuǎn)移到氯仿活化的硅膠固相萃取柱內(nèi)，依次用8 mL氯仿、16 mL丙酮和8 mL甲醇洗脫萃取柱，收集甲醇洗脫液于玻璃離心管內(nèi)，通風(fēng)櫥避光條件下純N2吹干甲醇相。

③甲酯化玻璃離心管內(nèi)加入1.0 mL甲醇-甲苯混合溶液（體積比1﹕1）和1.0 mL的0.2 mol·L-1KOH-甲醇溶液，混勻后35℃水浴15 min。冷卻至室溫后依次加入2.0 mL去離子水、0.3 mL的1 mol·L-1HAc和2.0 mL正己烷，渦旋30 s后2 500 r/min離心10 min，使用玻璃吸管吸取上層正己烷相于樣品瓶?jī)?nèi)（一樣一只吸管），重復(fù)上述步驟一次合并正己烷，通風(fēng)櫥內(nèi)避光條件下純N2吹干正己烷，即得到甲酯化磷脂脂肪酸（FAME）。

④PLFA圖譜分析樣品瓶?jī)?nèi)加入150 μL正己烷溶解樣品，加入50 μL的40 μg·mL-119:0甲基酯作內(nèi)標(biāo)用于定量，過氣相色譜柱（Agilent GC 7890A），利用美國(guó)MIDI公司開發(fā)的Sherlock Microbial Identification System（MIS）4.5系統(tǒng)進(jìn)行脂肪酸的比對(duì)鑒定。

（2）各微生物群落表征 研究認(rèn)為不同微生物群落的PLFA圖譜存在較大差異，而同一類群的微生物PLFA圖譜則很相近，因而可以利用某些特征PLFA表征某一類群的微生物[23]。通常：n14:0-n20:0為普通直鏈飽和脂肪酸，表征細(xì)菌/總微生物量[23]；18:1 ω9c、18:2 ω6c、18:3 ω6c、16:1 ω5c表征真菌（Fungi）群落微生物量[24-26]；16:0 10-methyl、17:0 10-methyl、18:0 10-methyl、17:1 w7c 10-methyl表征放線菌（Actinobacteria）群落微生物量[24, 27]；14:0 iso、15:0 iso/ anteiso、16:0 iso、17:0 iso/ anteiso、17:1 iso ω9c表征革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（G+）群落微生物量[6]；16:1ω7c、16:1ω9c、17:1ω8c、18:1ω7c、17:0 cycle ω7c、19:0 cycle ω7c表征革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）群落微生物量[6]；飽和直鏈脂肪酸、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（G+）、革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）和放線菌微生物量之和表示細(xì)菌群落微生物量，同時(shí)將所有微生物PLFAs總和表征為總微生物量。

（注：不同PLFA分子常以一系列C原子數(shù)目結(jié)合字母表示[28]，如18:1 ω6c，18代表脂肪酸含18個(gè)C原子，1代表含有一個(gè)雙鍵，ω及后面的數(shù)字代表雙鍵與脂肪端的距離；脂肪酸的順勢(shì)和反式構(gòu)型分別用字母c和t表示，字母標(biāo)在后面；有甲基異型存在時(shí)用anteiso和iso表示，分別指甲基在脂肪端末尾第3個(gè)和第2個(gè)C原子上；methyl表示甲基，前面的數(shù)字代表甲基距離羧基端距離；cycle表示為環(huán)丙烷脂肪酸。）

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS19.0和 Excel2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著檢驗(yàn)和相關(guān)分析并作圖。利用Canoco4.5軟件對(duì)微生物群落PLFA進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis，RDA）并作圖。

利用Shannon-Winner多樣性指數(shù)（）、Pielou平均度指數(shù)（）和Simpson豐富度指數(shù)（）以PLFA為指征計(jì)算微生物多樣性。計(jì)算公式如下：

=-ΣPlnP

=/ln

= 1-∑P2

式中，P是第種磷脂脂肪酸的相對(duì)豐度，即種特征磷脂脂肪酸的含量除以樣品中特征磷脂脂肪酸的總含量；為每個(gè)樣品中鑒定到的可供分析用的特征PLFA的種類數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 施用生物炭和炭基肥對(duì)土壤理化性質(zhì)影響

由表2可知不同處理間全鉀含量差異不顯著（＞0.05）；PMC和BF處理的pH最高，顯著高于BIO處理；CS和BF處理的土壤全氮含量最低，顯著低于PMC處理，BIO處理居間；BF和BIO處理有機(jī)質(zhì)含量最低，顯著低于PMC處理；PMC處理的土壤含水量最高，其他處理間沒有顯著差異。

2.2 施用生物炭和炭基肥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響

PMC處理的土壤微生物總PLFAs含量顯著高于其他處理（圖1），其余處理間則沒有顯著差異。細(xì)菌PLFAs含量仍以PMC處理最高，BF最低，CS和BIO處理居中且二者間無(wú)顯著差異。放線菌PLFAs含量以CS處理最低，與PMC處理存在顯著差異，BF和BIO處理居間無(wú)顯著性差異。BIO處理的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的PLFAs（圖2）含量均最低，與PMC處理存在顯著差異。

表2 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

每列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示Duncan多重比較不同處理差異顯著，數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。下同

Different small letters within one column mean significant difference of Duncan multiple range test among different treatments at 5% level. Data were expressed as means±SE. The same as below

圖1 不同處理土壤微生物的特征 PLFAs 含量

圖2 不同處理革蘭氏陽(yáng)性與陰性細(xì)菌菌落的特征 PLFAs 含量

不同處理間的Pielou均勻度指數(shù)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均沒有顯著差異（表3），Shannon-Winner多樣性指數(shù)BF處理顯著高于BIO處理， PMC和CS處理居間沒有顯著差異。真菌PLFAs/細(xì)菌PLFAs比值（圖3-a）BIO處理最低，其余3種處理之間沒有顯著差異，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌PLFAs/革蘭氏陰性細(xì)菌PLFAs比值（圖3-b）BF和PMC處理最低，顯著低于BIO處理。

2.3 土壤微生物PLFA與土壤理化指標(biāo)的關(guān)系

以不同PLFA為物種因子對(duì)不同理化指標(biāo)做約束性排序（RDA分析），利用蒙特卡羅P值檢驗(yàn)中有顯著貢獻(xiàn)（＜0.05）的環(huán)境因子與物種因子做物種-環(huán)境雙序圖（圖4），結(jié)果顯示，第1主軸和第2主軸分別解釋了微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)關(guān)系總變異的76.3%和6.4%；對(duì)PLFA豐度有顯著影響的土壤理化指標(biāo)及重要性排序分別是土壤pH、全氮、有機(jī)質(zhì)、含水量和全鉀（表4），其中含水量和全鉀對(duì)土壤微生物群落有顯著影響（< 0.05），pH、全氮和有機(jī)質(zhì)對(duì)土壤微生物群落有極顯著影響（< 0.01）。pH和全氮與16:1 ω7c、18:1 ω7c（G-）、15:0 iso、15:0 anteiso（G+）、16:1 ω5c、18:1 ω9c（真菌）和16:0 10-methyl、18:0 10-methyl（放線菌）存在明顯正相關(guān)，有機(jī)質(zhì)與16:1 ω5c 、18:2 ω6c（真菌）、17:0 cycle ω7c（G-）、17:0 anteiso（G+）相關(guān)性較高，含水量和17:1 w7c 10-methyl（放線菌）、16:1 ω9c（真菌）、17:0 iso（G+）和17:1 ω8c 、19:0 cycle ω7c（G-）相關(guān)性強(qiáng)，全鉀和17:0 10-methyl（放線菌）、16:0 iso、14:0 iso、17:1 iso ω9c（G+）和14:0、20:0（細(xì)菌）相關(guān)性較高。

表3 不同處理土壤微生物多樣性指數(shù)

圖3 不同處理土壤中真菌/細(xì)菌(a)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌(b)比

圖4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤化學(xué)性質(zhì)的RDA分析

相關(guān)分析結(jié)果表明（表5），土壤pH與真菌、革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌PLFAs含量極顯著相關(guān)，與放線菌PLFAs顯著相關(guān)；全氮與革蘭氏陽(yáng)性與陰性細(xì)菌PLFAs含量極顯著相關(guān)，與真菌與放線菌PLFAs含量顯著相關(guān)；有機(jī)質(zhì)與真菌PLFAs含量極顯著相關(guān)，與革蘭氏陽(yáng)性與陰性細(xì)菌PLFAs含量顯著相關(guān)；含水量與真菌、放線菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌PLFAs含量顯著相關(guān)；全鉀和總PLFAs與細(xì)菌PLFAs含量極顯著相關(guān)，和放線菌與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌PLFAs含量顯著相關(guān)。

表4 理化因子變量解釋的重要性排序與顯著性檢驗(yàn)

表5 土壤微生物不同群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性

*在0.05 水平上顯著相關(guān)。**在0.01水平上顯著相關(guān) * Mean significant difference at 0.05 level. ** Mean significant difference at 0.01 level

3 討論

各有機(jī)物料連續(xù)施用7年后，土壤理化性質(zhì)發(fā)生了較大變化。與試驗(yàn)前相比（土壤pH5.5，全氮0.86 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)15.3 g·kg-1，全鉀20.40 g·kg-1）不同處理pH、全氮、有機(jī)質(zhì)和全鉀含量均有所提高。生物炭制備過程中礦質(zhì)元素趨于離子態(tài)存在，損失不大，施入土壤后顯堿性可以提升土壤酸堿度[29]，其中炭基肥和豬廄肥處理提升幅度最大，這可能是炭基肥和腐熟的豬廄肥施入土壤后不會(huì)產(chǎn)生過多中間酸性產(chǎn)物[4]，而生物炭處理施用的生物炭顆粒添加了酸性膠結(jié)劑（各有機(jī)物料pH見表1），秸稈也會(huì)在土中腐解產(chǎn)生酸性物質(zhì)[4]。生物炭對(duì)土壤全氮含量的提高是由于在燒制過程中氮的狀態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)變[30]，出現(xiàn)較多以C-N雜環(huán)穩(wěn)定形態(tài)存在的氮[31]，施入土壤能夠長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定不易被分解[32]，與此相似，在碳素每年投入不等量的情況下（CS、BIO和BF分別為1 999.8、499.8和57.98 kg·hm-2，有機(jī)物料含碳量見表1），生物炭和炭基肥處理有效提高土壤有機(jī)質(zhì)含量且在長(zhǎng)期施用中與CS處理達(dá)到相同水平。

植物種類、土壤性質(zhì)以及土壤的管理方式是影響土壤微生物的主要因素[33]。本試驗(yàn)中PMC處理的各種微生物群落生物量均較為豐富，主要的原因有：腐熟的豬廄肥含有大量活性微生物，對(duì)于土壤起到“接種”的作用[34]；豬廄肥本身養(yǎng)分（主要是碳、氮）相較秸稈和生物炭更適宜微生物的繁殖[7]。生物炭對(duì)微生物的影響主要有兩方面，一是生物炭本身多孔性的微觀結(jié)構(gòu)和巨大比表面積可為微生物提供適宜生境[15]，二是生物炭除了本身能提供少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還可以通過吸附養(yǎng)分或改良土壤性質(zhì)間接影響微生物群落[13]。細(xì)菌一般是土壤微生物中的優(yōu)勢(shì)群落[6]，本試驗(yàn)中不同處理細(xì)菌PLFAs占總PLFAs含量的比值均在75%以上，生物炭對(duì)微生物的影響首先體現(xiàn)在細(xì)菌群落中，炭基肥處理由于所含生物炭量不高（57.98 kg·hm-2），對(duì)土壤細(xì)菌微生物群落的影響不及生物炭處理（499.8 kg·hm-2）顯著。細(xì)菌和真菌對(duì)土壤有機(jī)物質(zhì)的分解途徑不同，真菌易生存于低營(yíng)養(yǎng)、難分解以及低氮含量有機(jī)物的環(huán)境，底物循環(huán)時(shí)間偏長(zhǎng)；細(xì)菌則相反，偏好生存在營(yíng)養(yǎng)豐富、有機(jī)物易于分解的土壤中，底物周轉(zhuǎn)快[35]。本研究中生物炭處理的真菌PLFAs含量最低，相較豬廄肥處理不利于真菌積累?？赡艿脑蚴钦婢L(zhǎng)并不過多依賴生物炭孔隙和生物炭帶來(lái)的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，而試驗(yàn)所用的玉米芯生物炭也沒能提供足夠數(shù)量的適宜真菌生存的孔隙[15]。JIN等[36]施用生物炭的改土試驗(yàn)還曾發(fā)現(xiàn)過真菌遺傳多樣性和數(shù)量減少的現(xiàn)象。

微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)乎生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康[6, 37]，F(xiàn)TDE等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，真菌/細(xì)菌生物量比值與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關(guān)，一些研究[42]也表明真菌/細(xì)菌生物量比值與微生物多樣性存在相關(guān)性。本研究中炭基肥處理的Shannon-Winner多樣性指數(shù)和真菌/細(xì)菌比值均最高，顯著高于生物炭處理，說(shuō)明相較生物炭處理施用炭基肥更有利于提高土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)多樣性，生物炭處理相較炭基肥處理更有利于細(xì)菌群落PLFAs生物量的生長(zhǎng)是引起這一差異的原因。支鏈飽和脂肪酸與環(huán)化單烯等不飽和脂肪酸通常分別是革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的特征標(biāo)記物[25]，其比值也常用來(lái)表示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[39]及與環(huán)境的關(guān)系[38, 40]，比值高低與環(huán)境脅迫程度有關(guān)[20]。本研究中生物炭處理的G+/G-比值最高，說(shuō)明施用生物炭對(duì)土壤微生物的脅迫程度較施用豬廄肥和炭基肥要高一些。但生物炭處理的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌PLFAs含量均低于豬廄肥處理，說(shuō)明相比豬廄肥，生物炭處理更不利于革蘭氏陰性細(xì)菌的積累，這與STEINBEISS等[12]的研究施入生物炭能增加土壤革蘭氏陰性細(xì)菌生物量的結(jié)論似有不符，但本試驗(yàn)中炭基肥處理卻沒有這種現(xiàn)象，可能的原因是炭基肥和生物炭處理施入土壤的純生物質(zhì)炭量不同（BIO和BF分別為499.8 kg·hm-2和57.98 kg·hm-2），導(dǎo)致不同處理土壤微生物受脅迫程度不同。

土壤理化性質(zhì)如pH、含水量、有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分也是影響土壤微生物群落的重要因素[20, 41]。本研究RDA分析結(jié)果顯示，pH、全氮和有機(jī)質(zhì)對(duì)土壤微生物影響最大，呈極顯著相關(guān)，這與許多研究結(jié)果[6-7, 42]類似，pH對(duì)微生物適宜生存環(huán)境影響巨大[2]，氮素是微生物必不可少的養(yǎng)分元素[1]，而有機(jī)質(zhì)是土壤養(yǎng)分最重要的衡量指標(biāo)，說(shuō)明這三種因素是影響本試驗(yàn)微生物群落的關(guān)鍵因子，其他顯著影響因子還包括土壤含水量與全鉀。但在重要性排序上pH位于全氮和有機(jī)質(zhì)之前，此結(jié)果似乎和一些文獻(xiàn)[7]相沖突，這主要有以下幾方面原因：首先全氮和有機(jī)質(zhì)并不是對(duì)所有微生物群落有顯著影響，由表5可知全氮和有機(jī)質(zhì)只是與部分微生物群落極顯著相關(guān)，全氮與革蘭氏陽(yáng)性與陰性細(xì)菌，有機(jī)質(zhì)與真菌，而土壤pH與真菌、革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌均極顯著相關(guān)；其次生物炭等有機(jī)物料擁有巨大的比表面積，pH的變化會(huì)對(duì)生物炭表面可變負(fù)電荷產(chǎn)生影響，造成銨態(tài)氮和磷素等營(yíng)養(yǎng)元素的吸附障礙從而影響其對(duì)土壤微生物的有效性[2]。

生物炭被認(rèn)為是改善土壤肥力和土壤生態(tài)，可通過固碳減緩氣候變化的有效手段[10,18]，其對(duì)土壤的影響機(jī)理[4,8,10,21]多被解釋為通過提高土壤pH和吸附作用改善土壤養(yǎng)分利用情況，同時(shí)改變土壤微生物群落組成及豐度[12,18-19]，進(jìn)而對(duì)土壤養(yǎng)分循環(huán)或理化性質(zhì)產(chǎn)生作用[11-12]，最終影響作物生長(zhǎng)[11]。這些研究多數(shù)集中在土壤性質(zhì)或微生物分化差異上，關(guān)于施用生物炭的土壤在功能微生物作用下養(yǎng)分變異過程的內(nèi)涵并沒有系統(tǒng)深入闡述。現(xiàn)有的研究[3-4,8-12,18]為未來(lái)關(guān)于生物炭對(duì)土壤微生物群落功能性的研究提供了廣闊思路，如不同生物炭與土壤不同養(yǎng)分及相關(guān)酶與功能微生物的互作，生物炭與更廣泛的微生物（土壤動(dòng)物等）功能性研究，除本文研究的炭基肥外的生物炭菌劑等生物炭功能性產(chǎn)品，生物炭微生物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)等方面[18]都值得我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

4 結(jié)論

長(zhǎng)期施用生物炭和炭基肥可以改善土壤的理化性質(zhì)。相較豬廄肥，施用生物炭不利于真菌和革蘭氏陰性細(xì)菌群落生物量的積累，且施用生物炭和炭基肥對(duì)土壤微生物群落的影響不同，施用生物炭可以顯著提高土壤細(xì)菌生物量，施用炭基肥能顯著提高土壤微生物Shannon-Winner多樣性指數(shù)和真菌/細(xì)菌比以及降低革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌比，有利于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性提高。

長(zhǎng)期應(yīng)用生物炭等有機(jī)物料培肥改土后，土壤理化指標(biāo)對(duì)微生物群落產(chǎn)生顯著影響的因子及重要性依次為pH、全氮、有機(jī)質(zhì)、含水量和全鉀，其中前3種因素的影響極顯著。

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（責(zé)任編輯 李云霞）

Effects of Biochar and Biochar-based Fertilizer on Soil Microbial Community Structure

CHEN Kun, XU XiaoNan, PENG Jing, FENG XiaoJie, LI YaPeng, ZHAN XiuMei, HAN XiaoRi

(College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University/National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, Shenyang 110866)

【Objective】Microbes play the key role of switcher in soil nutrient cycling, the aim of this paper was to study the effects of soil microbial community structure by long-term fertilization of biochar and biochar-based fertilizer, and to provide theory reference on reasonable administration of different organic fertilizers, contrasting with traditional organic fertilizer (corn straw and piggery manure compost) in the meantime. 【Method】 This research was based on the long-term experiment of soil improvement of brown soil in Shenyang agricultural university (began in 2009). The changes of soil physic-chemical properties, soil microbial community structure and their relationship by long-term organic fertilizer plus NPK fertilization were studied by PLFA and correlatively analysis. Soil samples were collected from treatments as farmland with biochar-based compound fertilizer (BF) alone and farmland with piggery manure compost (PMC), corn straw-returning (CS), biochar (BIO) combination of NPK fertilizer, respectively. 【Result】Soil pH of PMC and BF were higher than BIO significantly; total N (TN) of PMC was significantly higher than BF and CS, which of BIO had no significant difference with PMC; soil organic matter (SOM) of PMC was significantly higher than that of BF and BIO; moisture content (MC) of PMC was the highest of all treatments; total K (TK) of all treatments had no significant difference. Total PLFAs of PMC was significantly higher than other treatments, but there were no significant differences among others; bacteria PLFAs of PMC was the highest of all treatments, which of BF was significantly lower than BIO and CS; fungi, gram-positive, gram-negative PLFAs of PMC were significantly higher than BIO, which of BF had no significant difference with PMC; actinomyces PLFAs of PMC was higher than CS significantly, there were no significant differences between BIO and BF. The result of analysis showed that Shannon-Winner richness index () and the fungi/bacteria PLFAs ratio of BF was higher than BIO significantly, the gram- positive/gram-negative PLFAs ratio of BF and PMC were lower than BIO significantly. The result of redundancy analysis (RDA) showed that microbial PLFA was significantly influenced (<0.01) by soil pH, TN and SOM, and significantly influenced (<0.05) by MC and TK.【Conclusion】Soil physico-chemical properties were obvious improved by long-term fertilization of biochar and biochar-based compound fertilizer. Compared to PMC, farmland with BIO was bad for the growth of fungi and gram-negative microbe, and farmland with BIO and BF had different effects on soil microbial community structure, namely, farmland with BIO could increase the biomass of bacteria, while farmland with BF could increase the fungi/bacteria ratio and the diversity of soil microbial community structure. Soil pH, TN, SOM, MC and TK were the important factors which influence the soil microbe community structure in this study in the order.

biochar; biochar-based compound fertilizer; PLFA; community structure; soil microbe

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.011

2017-06-27；

2017-10-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（41201283）、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303095-15）、國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAD23B05）

陳坤，E-mail：chenkun083@163.com。通信作者戰(zhàn)秀梅，E-mail：xiumeizhan@163.com