□ 張?zhí)煊?謝志雄 武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

1 前言

二氧化鈦具有高亮度、高折射率、良好的抗污性、耐光性等特性，被廣泛用作食品添加劑和色素[1]，二氧化鈦是符合我國(guó)GB2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的食品添加劑，其最大添加劑量可達(dá)1%[2]。

最近在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，食品級(jí)二氧化鈦會(huì)在小腸上皮細(xì)胞表面聚沉，并且會(huì)導(dǎo)致小腸絨毛結(jié)構(gòu)損傷，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小腸吸收效率降低[3-4]；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，一次性口服100 mg食品級(jí)二氧化鈦后，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析發(fā)現(xiàn)，2 h后二氧化鈦會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并在6 h達(dá)到峰值[5]，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中的二氧化鈦顆粒會(huì)聚集在許多器官中，由于肝臟和腎臟是重要的解毒和代謝器官，二氧化鈦顆粒在兩個(gè)部位的聚集尤其突出，推測(cè)這些二氧化鈦可能會(huì)造成肝、腎功能損傷[6]。但是，這些研究的實(shí)驗(yàn)體系并不符合日常生活中食品級(jí)二氧化鈦的攝入方式。

為了更好探究日常生活中口服攝入的食品級(jí)二氧化鈦（最高添加劑量1%）是否會(huì)對(duì)肝腎功能、小腸結(jié)構(gòu)和吸收效率等產(chǎn)生影響，采用大鼠模型連續(xù)四周以每?jī)商旃辔肝故呈称芳?jí)二氧化鈦顆粒溶液1 000 mg/kg體重/次的頻率進(jìn)行了探究。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 二氧化鈦

食品級(jí)二氧化鈦（GB25577-2010），購(gòu)自上海江滬鈦白化工制品有限公司。

2.1.2 大鼠

SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)于自湖北省疾病預(yù)防控制中心。大鼠均為雄性，6周齡，體重230±6 g。

2.1.3 試劑和溶液

組織固定液：購(gòu)于武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司。

木糖檢測(cè)試劑盒：購(gòu)于南京信帆生物技術(shù)有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.2.1 大鼠的飼養(yǎng)和灌胃處理

大鼠自湖北省疾病控制中心買回后，飼養(yǎng)在武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房中，實(shí)驗(yàn)開始前十天為大鼠適應(yīng)動(dòng)物房生活時(shí)期。動(dòng)物房光照條件為12 h黑暗、12 h光照，食物和水均可自由獲得。大鼠均為1只/籠，以排除大鼠間的相互影響。

實(shí)驗(yàn)開始后，將大鼠按6只/組隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠以每?jī)商煲淮蔚念l率灌胃喂食1 000 mg/kg體重的二氧化鈦，對(duì)照組以相同頻率灌胃喂食相同體積的無(wú)菌水，連續(xù)灌胃處理四周。

2.2.2 肝腎功能指標(biāo)的獲取

灌胃四周后，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉處理，通過(guò)頸動(dòng)脈取血1 mL后3 000 rpm離心10 min，取血清利用血液生化分析儀進(jìn)行生化指標(biāo)的測(cè)量。

2.2.3 小腸吸收效率的測(cè)評(píng)

以D-木糖吸收效率評(píng)估小腸吸收效率，方法如下：灌胃四周后，禁食大鼠12 h，灌胃喂食0.8 g/kg體重D-木糖；2 h后麻醉大鼠，通過(guò)頸動(dòng)脈取血1 mL后3 000 rpm離心10 min，取血清；然后利用D-木糖檢測(cè)試劑盒測(cè)量血清中D-木糖的含量；最后，用血清中的D-木糖含量評(píng)估實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠小腸的吸收效率。

2.2.4 小腸生理切片的制備

灌胃四周后，將大鼠進(jìn)行麻醉處理，取小腸后浸于組織固定液24 h。固定完成后，委托武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行石蠟包埋和切片的制備。

2.2.5 食物、水消耗量和體重增長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)

在灌胃期間，每?jī)商鞙y(cè)量一次食物消耗量、飲水量和體重?cái)?shù)據(jù)。

2.2.6 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中大鼠數(shù)量均≥3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯著性分析利用SigmaPlot 12.5的T檢驗(yàn)進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 口服二氧化鈦對(duì)肝、腎功能的影響

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLOB）的含量一般作為肝功能檢測(cè)的主要指標(biāo)，肝臟被損傷時(shí)，血清中的ALT和AST含量會(huì)升高，而ALB含量會(huì)降低[7]；血清中尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）的含量以及尿素氮與肌酐的比值（BUN/CREA）一般作為腎功能檢測(cè)的主要指標(biāo)，腎臟被損傷時(shí)，血清中的BUN、CREA和UA含量會(huì)增加[8]。

圖1 灌胃四周后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟、腎臟功能指標(biāo)

通過(guò)對(duì)大鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和腎臟功能指標(biāo)均與對(duì)照組大鼠沒有產(chǎn)生顯著性差異（如圖1所示）。結(jié)果表明，持續(xù)四周每?jī)商旃辔敢淮? 000 mg/kg體重食品級(jí)二氧化鈦不會(huì)對(duì)大鼠肝、腎臟功能造成顯著影響。

3.2 口服二氧化鈦對(duì)小腸結(jié)構(gòu)和功能的影響

利用小腸生理切片和D-木糖的吸收實(shí)驗(yàn)評(píng)估了二氧化鈦對(duì)小腸生理結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生的影響[9]。通過(guò)對(duì)小腸切片的觀察和分析發(fā)現(xiàn)灌胃喂食四周后，大鼠小腸上皮和絨毛結(jié)構(gòu)完整，沒有出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，上皮細(xì)胞也沒有出現(xiàn)明顯的壞死、脫落現(xiàn)象（如圖2所示）。

D-木糖的吸收實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)四周的灌胃喂食食品級(jí)二氧化鈦并沒有對(duì)小腸的吸收功能造成顯著性的影響（如圖3所示）。

3.3 口服二氧化鈦對(duì)體重增長(zhǎng)的影響

通過(guò)對(duì)四周內(nèi)大鼠食物消耗量和飲水量的統(tǒng)計(jì)與分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠在飲水和食量上并沒有顯著差異，表明食品級(jí)二氧化鈦并沒有導(dǎo)致大鼠厭食或者暴飲暴食，大鼠的體重增長(zhǎng)速度也表明，灌胃喂食二氧化鈦并沒有對(duì)大鼠的體重增長(zhǎng)產(chǎn)生影響（如圖4所示）。

圖2 灌胃四周后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的小腸生理切片

圖3 D-木糖吸收實(shí)驗(yàn)

4 討論

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠在灌胃處理四周內(nèi)的飲水量和食用食物量（左）和體重增長(zhǎng)（右）

隨著公眾對(duì)健康飲食關(guān)注度的提升，食品級(jí)二氧化鈦?zhàn)鳛槭称诽砑觿┖蜕氐臐撛谟绊懸鹆藦V泛的關(guān)注。以往對(duì)二氧化鈦食品添加劑安全性評(píng)估的研究多是通過(guò)靜脈、腹膜注射或者體外實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行。但是，在日常生活中，我們攝入體內(nèi)的食品級(jí)二氧化鈦絕大部分是通過(guò)口服途徑，所以，以往研究的實(shí)驗(yàn)體系并不能很好評(píng)估二氧化鈦食品添加劑的生物安全性。本實(shí)驗(yàn)利用灌胃喂食大鼠食品級(jí)二氧化鈦進(jìn)行評(píng)估的體系和模型，使實(shí)驗(yàn)條件更貼近生活中的自然狀態(tài)，相較于之前研究中的實(shí)驗(yàn)體系，評(píng)估方式更合理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更能反映實(shí)際情況，更適合評(píng)估食品級(jí)二氧化鈦生物安全性。

在以往體外實(shí)驗(yàn)中，小腸絨毛結(jié)構(gòu)直接浸泡于含有二氧化鈦的培養(yǎng)基中，二氧化鈦會(huì)由于重力作用聚集在小腸絨毛表面，損傷小腸絨毛結(jié)構(gòu)和功能[4]，而在日常生活中，由于腸胃的蠕動(dòng)、腸道上皮細(xì)胞死亡、再生和腸道粘膜的屏障作用，口服進(jìn)入腸道的二氧化鈦對(duì)小腸絨毛生理結(jié)構(gòu)和功能的影響會(huì)減弱，所以，我們的實(shí)驗(yàn)體系更貼近生活中的實(shí)際情況；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)靜脈等途徑注射的二氧化鈦會(huì)直接進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，聚集在諸多器官中[10]，影響器官功能[6]，而實(shí)際生活中進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)和器官中的二氧化鈦總量較少，本實(shí)驗(yàn)建立的模型更貼近日常狀態(tài)下的積累量。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立比之前相關(guān)研究中更合理的評(píng)估體系，發(fā)現(xiàn)持續(xù)四周口服攝入含有1%食品級(jí)二氧化鈦食物添加劑的食物不會(huì)造成大鼠小腸絨毛結(jié)構(gòu)和肝、腎功能損傷，表明國(guó)家規(guī)定的食物中最高1%的食品級(jí)二氧化鈦食物添加劑量屬于安全劑量。本文對(duì)合理評(píng)估食品級(jí)二氧化鈦應(yīng)用的安全性具有重要的參考價(jià)值，為食品級(jí)二氧化鈦食物添加劑安全使用劑量提供了依據(jù)。

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