張選明 李培江 張志奇 沙志鴻 劉志立 王小紅 顧朝軍 嚴(yán)洪慶

摘 要：水稻稻瘟病是漢中地區(qū)水稻的主要病害之一，選育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。該研究以同時(shí)含有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-km的蜀恢527，含有稻瘟病抗性基因Pi-b的R150為基因供體配置雜交組合，利用Pi-ta、Pi-km和Pi-b的基因標(biāo)記對分離世代進(jìn)行基因位點(diǎn)檢測，結(jié)合田間多代選育、抗性篩選將3個(gè)基因轉(zhuǎn)育到同一品種，通過分子標(biāo)記與田間多代性狀篩選，選育出抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新品種“陜恢206”。研究表明，利用分子標(biāo)記輔助選擇，為選育多抗水稻品種提供了簡單、便捷的選育方法，同時(shí)也為水稻抗病育種提供了新的遺傳資源。

關(guān)鍵詞：水稻；稻瘟??；分子標(biāo)記輔助選擇；Pi-ta；Pi-km；Pi-b

中圖分類號 S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）09-0019-04

Application of Marker-Assisted Selection in Breeding of Shanhui 206

Zhang Xuanming et al.

（Shaanxi Rice Research Institute，Hanzhong 723000，China）

Abstract：Rice blast is the main disease of rice in Hanzhong area，breeding resistant varieties is the most effective way to prevent rice blast.Shuhui 527，containing both Pi-ta and Pi-km，was crossed with R150 which carried Pi-b.Three gene-markers Pi-ta and Pi-km and Pi-b were used for marker-assisted selection in each segregating generation.After the multi-generation breeding and identification of resistance，three resistance genes were put together finally.Through the molecular marker and field multi-generation character，breeding new varieties of disease resistance，high yield and high quality rice "Shanhui 206".These results indicated that marker-assisted selection could not noly be a simple and effective way but also provide genetic resources for breeding new rice multi-resistant varieties.

Key words：Rice；Rice blast；Marker-Assisted Selection；Pi-ta；Pi-km；Pi-b

稻瘟病是由子囊真菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻病害，其危害面積與危害程度日趨嚴(yán)重，已成為限制水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因子[1-2]。實(shí)踐證明，培育抗性品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。由于稻瘟病病菌具有耐藥性、易變異等特點(diǎn)，導(dǎo)致單一抗性品種不能夠長期保持抗性。因此，篩選和利用廣譜抗性基因以及利用分子技術(shù)將多個(gè)抗性基因整合到一個(gè)品種中，是選育持久抗性品種的必然趨勢[3-4]。

傳統(tǒng)的抗性育種主要依賴于表現(xiàn)型，而表現(xiàn)型容易受環(huán)境以及人為因素的干擾，從而降低了選育結(jié)果的可靠性及抗病育種效率。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，水稻抗性育種已從傳統(tǒng)技術(shù)轉(zhuǎn)向分子技術(shù)，DNA分子標(biāo)記、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）以及水稻全基因組測序的完成，都極大地推進(jìn)了運(yùn)用分子手段進(jìn)行抗性育種，由于其直接、快捷、可靠且不受環(huán)境干擾的優(yōu)點(diǎn)，也越來越受到人們的關(guān)注。截至2015年3月，已至少報(bào)道了69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共84個(gè)主效基因，其中，Pi-ta，Pi-b，Pi-zt，Pi1，Pi2，Pi5，Pi9等24個(gè)基因已被成功克隆[5]。Pi-ta位于水稻第12染色體靠近著絲點(diǎn)附近的區(qū)域，由928個(gè)氨基酸殘基編碼組成的富含亮氨酸重復(fù)序列的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白[6]。Pi-b是來自日本抗性材料BL-1，該基因位于水稻第2染色體長臂近末端區(qū)域[7]。Ashikawa等通過序列分析和遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明，Pi-km是由2個(gè)緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類基因（Pi-km-TS和Pi-km2-TS）組成[8]。

本研究利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi-km的特異性分子標(biāo)記對育種分離世代水稻材料進(jìn)行基因聚合，并結(jié)合田間世代選育，稻瘟病抗性鑒定，快速、準(zhǔn)確選育出抗稻瘟病、產(chǎn)量高、優(yōu)質(zhì)新品種。不僅為水稻抗病育種提供了一種簡單、快捷的選擇方法，同時(shí)為水稻抗病育種提供了新的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料 強(qiáng)優(yōu)抗病恢復(fù)系蜀恢527，含有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-km，但不含抗性基因Pi-b；自育優(yōu)質(zhì)、秈粳交中間材料R150，含有稻瘟病抗性基因Pi-b；不育系陜農(nóng)1A，中九A，宜香1A，內(nèi)香5A。

1.2 抗病基因標(biāo)記的選擇 選擇抗病基因Pi-ta在DNA序列上的單核苷酸長度多態(tài)性設(shè)計(jì)的等位基因特異性PCR引物YL155/YL87，用于檢測Pi-ta基因[9]。選擇抗病基因Pi-b在DNA序列上的多態(tài)性設(shè)計(jì)的特異性引物Pi-bdomF/Pi-bdomR，用于對Pi-b基因的選擇[10]。由于Pi-km基因是由兩個(gè)緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類基因組成，分別對2個(gè)基因設(shè)計(jì)引物Dkm1和Dkm2，用于檢測Pi-km基因。引物名稱、序列和擴(kuò)增片段預(yù)期大小見表1，引物由上海生工公司合成。

1.3 DNA提取 采集分蘗盛期的試驗(yàn)材料葉片，用CTAB法提取全基因組DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳 PCR擴(kuò)增體系為20μL：2μL 10×buffer，2μL DNA，2μL dNTP，1μL正反引物，0.5μL MgCl2，0.5μL Taq酶，11μL蒸餾水，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃、45s，52℃、1min，72℃、45s，擴(kuò)增重復(fù)34次，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，紫外燈下觀察和檢測。為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性，每個(gè)DNA樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合Pi-ta、Pi-b和Pi-km基因 利用Pi-ta的基因標(biāo)記對抗性基因的供體親本和受體親本PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Pi-ta標(biāo)記能夠在供體親本中擴(kuò)增出1042bp的目的條帶，在受體親本中不能擴(kuò)增出目的條帶。因此可以利用這對基因標(biāo)記對分離群體中含有Pi-ta抗性的單株進(jìn)行選擇（圖1）；利用Pi-b的基因標(biāo)記對抗性基因的供體親本和受體親本PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Pi-b標(biāo)記能夠在供體親本中擴(kuò)增出365bp的目的條帶，在受體親本中不能擴(kuò)增出目的條帶。因此可以利用這對基因標(biāo)記對分離群體中含有Pi-b抗性的單株進(jìn)行選擇（圖2）；利用Pi-km的基因標(biāo)記對抗性基因的供體親本和受體親本PCR檢測發(fā)現(xiàn)，供體親本中能夠同時(shí)擴(kuò)增出223bp和291bp的目的條帶，在受體親本中2條目的條帶不能同時(shí)擴(kuò)增出。因此可以利用這對基因標(biāo)記對分離群體中含有Pi-km抗性的單株進(jìn)行選擇（圖3、4）。

利用3對基因的分子標(biāo)記對F4代分離群體的128個(gè)綜合性狀表現(xiàn)好的單株進(jìn)行選擇，獲得了10株同時(shí)含有Pi-ta（純合）、Pi-b（純合）和Pi-km（純合）抗病基因的單株。

2.2 聚合后代的抗性表現(xiàn)和農(nóng)藝性狀系統(tǒng)選育 2009年，將獲得的10個(gè)單株分別種植成160苗的株系，用來自四川和漢中不同地區(qū)的5個(gè)稻瘟病生理小種對不同株系進(jìn)行苗瘟和穗頸瘟接種鑒定，結(jié)果表明，10個(gè)株系對苗瘟和穗頸瘟都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性。同時(shí)通過對分蘗力、成穗率、莖稈粗細(xì)等農(nóng)藝性狀的比較，選擇綜合性狀較好的單株20株進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，加快穩(wěn)定，于2009年冬在海南三亞進(jìn)行種植，優(yōu)選單株22株，于2010年在漢中種植，優(yōu)選單株16株，進(jìn)行編號，分別與陜農(nóng)1A等多個(gè)不育系進(jìn)行測配，其中編號為206株系與陜農(nóng)1A所配組合結(jié)實(shí)率高，豐產(chǎn)性好，抗性強(qiáng)，米質(zhì)優(yōu)，表現(xiàn)突出。該株系經(jīng)與多個(gè)不育系陜農(nóng)1A，中九A，宜香1A，內(nèi)香5A配組，F(xiàn)1代均表現(xiàn)結(jié)實(shí)率高，抗性強(qiáng)。該株系經(jīng)5年南繁北育加代系統(tǒng)選育，現(xiàn)已進(jìn)入F12代，表現(xiàn)遺傳性穩(wěn)定，分蘗力強(qiáng)、米質(zhì)優(yōu)、抗性強(qiáng)，定名為“陜恢206”，選育過程如圖5所示。

圖5 “陜恢206”的選育過程

2.3 “陜恢206”農(nóng)藝性狀 “陜恢206”綜合性狀好，全生育期162d，分蘗力較強(qiáng)，成穗率高，平均每穗總粒數(shù)168.6粒，結(jié)實(shí)率平均90.4%，千粒重平均32g，株高平均126.8cm，莖稈粗壯，抗倒伏，成熟轉(zhuǎn)色佳，株葉形態(tài)良。稻米外觀透明，堊白度2.1%，直鏈淀粉含量17.4%，膠稠度84mm，粒長寬比3.4，蛋白質(zhì)含量8.3%，整體米質(zhì)指標(biāo)符合GB/17891—1999《優(yōu)質(zhì)稻谷》二級標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)陜西省水稻研究所植保研究室抗病性鑒定，多點(diǎn)誘發(fā)鑒定表明：“陜恢206”對穗頸瘟病表現(xiàn)為高抗，對葉瘟表現(xiàn)為中抗；對紋枯病表現(xiàn)為中感；對稻曲病表現(xiàn)為中抗；人工接菌對白葉枯病表現(xiàn)為中感。

3 討論

選育抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新品種仍是現(xiàn)階段的主要育種目標(biāo)，其中稻瘟病是我們一直致力攻克的對象。由于不同稻區(qū)的稻瘟病菌生理小種有可能不同，品種所表現(xiàn)的抗病性常常表現(xiàn)較大的差異。傳統(tǒng)的改良品種抗性，往往需要依賴抗性鑒定和表型選擇，而表現(xiàn)型受環(huán)境因素的干擾，選擇效率低、工作量大、育種周期長，從而增加了育種難度。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，推動了分子育種進(jìn)程，而定位和克隆的大量稻瘟病抗性基因?yàn)镸AS技術(shù)開展抗性育種奠定了基礎(chǔ)。隨著分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的日益成熟，不但可加速抗病育種進(jìn)程，還可以提高育種效率，越來越多的育種家利用與抗稻瘟病基因連鎖的分子標(biāo)記開展了水稻抗稻瘟病的分子標(biāo)記輔助育種工作。由于稻瘟病生理小種的區(qū)域性差異和潛在的突變性，單一抗性基因不足以提高水稻的抗病性，因此，聚合多個(gè)抗病性基因到同一優(yōu)良植株中是提高植株持久抗病性的有效手段。劉仕平等[11]研究表明，多個(gè)抗性基因的聚合后，并不簡單的是單個(gè)抗病基因的抗譜之間的簡單累加，而是抗性基因之間表現(xiàn)為極顯著的基因互作，從而促使抗譜拓寬，抗性增強(qiáng)，使其能夠抵抗單個(gè)抗病基因不能抵抗的生理小種。在聚合多個(gè)稻瘟病抗性基因方面，王軍等[12]利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和條紋葉枯病抗病基因Stv-bi，選育出多抗、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)粳稻新品系74121。劉武革等[13]利用分子標(biāo)記輔助選擇將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2聚合到兩系不育系GD-7S中，獲得的后代既保持了GD-7S的農(nóng)藝性狀和配合力，又提高了株系的抗性水平。陳紅旗等[14]利用分子標(biāo)記輔助選擇將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2、Pi-33聚合到金23B中，培育出廣譜、持久抗稻瘟病新材料W1。陳學(xué)偉等[15]將Pi-d（t）、Pi-b和Pi-ta抗性基因聚合到保持系雜交品種G46B中，顯著提高了稻瘟病抗性水平。

4 結(jié)論

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km分子標(biāo)記對后代分離群體進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，并結(jié)合田間抗性鑒定和常規(guī)育種技術(shù)，成功的將3個(gè)抗病基因進(jìn)行聚合，選育出抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系水稻新品種“陜恢206”。實(shí)踐證明，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對抗性基因進(jìn)行檢測和篩選，再通過常規(guī)育種技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地聚合多個(gè)抗病基因，為水稻抗病育種提供一種高效、簡單、快捷的選育方法。

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（責(zé)編：張宏民）