瞿恒賢，余洪波，黃瑩萍，席文博，黃玉軍，顧瑞霞，陳大衛(wèi)，*

（1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2.統(tǒng)一企業(yè)（中國(guó)）投資有限公司，江蘇昆山215300）

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝病，包括簡(jiǎn)單脂肪變性，非酒精性脂肪肝炎，纖維化，肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。NAFLD的標(biāo)志是脂質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)積累，導(dǎo)致在肝細(xì)胞內(nèi)形成脂滴。這種積累是由脂質(zhì)合成和氧化之間的不平衡引起的[2-4]。與正常健康者相比，NAFLD患者呈現(xiàn)高水平的活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，而抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）和抗氧化劑谷胱甘肽（glutathione、GSH）等的表達(dá)降低[5]。目前，對(duì)非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制廣泛接受的理論是“二次打擊”學(xué)說(shuō)[6]。第一次打擊主要是脂肪代謝失衡和胰島素抵抗導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞中的沉積；第二次打擊即在第一次打擊的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體功能失調(diào)，在細(xì)胞因子等共同作用下，引起脂肪性肝炎，進(jìn)一步形成肝硬化，甚至肝癌[7-8]。脂質(zhì)過(guò)氧化是NAFLD肝細(xì)胞損傷的主要原因[9-11]?；钚匝跬ǔＳ烧＜?xì)胞的代謝產(chǎn)生，但肝臟脂質(zhì)積累導(dǎo)致過(guò)氧化自由基不能狗夠被抗氧化防御抵消，從而誘發(fā)肝損傷[12]。

益生菌對(duì)NAFLD的作用越來(lái)越受到重視，大量研究表明，益生菌可以有效地預(yù)防和改善NAFLD。Ritze等[13]報(bào)道了鼠李糖乳桿菌對(duì)NAFLD的保護(hù)作用，在高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠中，有益細(xì)菌數(shù)量增加，腸屏障功能恢復(fù)，肝臟炎癥和脂肪變性也隨之減弱。Paik等[14]也發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的大鼠在食用芽孢桿菌屬（Bacillus）6周后，血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和脂質(zhì)過(guò)氧化水平均得以明顯改善。然而，盡管益生菌對(duì)NAFLD有明顯的有益作用，但其影響機(jī)制尚未完全明了。

脂質(zhì)過(guò)氧化（lipid peroxidation）在NAFLD中扮演著重要角色[15]，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益生菌通過(guò)拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而減輕肝臟炎癥[16-17]。本研究通過(guò)高脂飲食成功誘導(dǎo)SD雄性大鼠建立脂質(zhì)過(guò)氧化損傷模型，應(yīng)用單一及混合益生菌發(fā)酵乳進(jìn)行干預(yù)，觀察益生菌對(duì)肝功能、肝內(nèi)臟脂肪堆積以及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷狀態(tài)，評(píng)價(jià)益生菌對(duì)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的拮抗效應(yīng)，并探究其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 益生菌菌株

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LV108、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）grx08、干酪乳桿菌（L.casei）grx12：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

5804R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；RM225組織切片機(jī)：德國(guó)萊卡公司；Axiocam erc5s型生物顯微鏡：德國(guó)Carl.Zeiss公司；7020型全自動(dòng)生化分析儀：日本株式會(huì)社日立制作所。

1.2.2 主要試劑

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、TC、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、LDL-C、超氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）、SOD、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

5周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量約150 g：揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心?；A(chǔ)飼料（面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、魚粉2%、骨粉2%）適應(yīng)性飼喂1周，適應(yīng)有規(guī)律的12 h白天/12 h黑夜的循環(huán)，然后按各組間平均體重?zé)o顯著差異隨機(jī)分成4組，每組各10只，選取一組作為空白對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料，其余3組通過(guò)飼喂4周高脂飼料（10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇和0.2%膽鹽和78.8%基礎(chǔ)飼料）建立高血脂大鼠模型。4周末，各組隨機(jī)選取一只處死進(jìn)行肝臟HE染色，確定造模成功，造模成功后進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，時(shí)間為4周。

動(dòng)物分組與處理如下：空白組，日常飼喂普通飼料，灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g）；模型組，日常飼喂高脂飼料，灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g）；LV108組，日常飼喂高脂飼料，灌胃給予LV108發(fā)酵乳（1 mL/100 g，109CFU/mL）；混合發(fā)酵乳組，日常飼喂高脂飼料，灌胃給予簡(jiǎn)單混合發(fā)酵（1 mL/100 g，109CFU/mL），體積比LV108發(fā)酵乳 ∶grx08發(fā)酵乳 ∶grx12發(fā)酵乳=1∶1∶1。定時(shí)補(bǔ)充飲水和飼料，更換墊料。

1.4 標(biāo)本的采集與處理

大鼠禁食12 h后，眼球取血，以12 000 r/min分離血清，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取肝臟，稱重，取肝臟左葉，大小1 cm×1 cm×0.5 cm，4%多聚甲醛固定，存于4℃冰箱中備用；另取0.8 g組織塊，在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，沖去表面血液，然后濾紙拭干，稱重后放入燒杯中。加入預(yù)冷的pH值為7.4 Tris-HCl（體積比1∶9的勻漿液），迅速用手術(shù)剪刀剪成碎塊。組織勻漿器進(jìn)行勻漿操作，然后在 4℃條件下離心（4 000×g，15 min），吸取上清液，存于-80℃冰箱中備用。

1.5 大鼠體重及飲食量

每周測(cè)定一次大鼠的體重，每天記錄每組大鼠飲食量。大鼠處死前測(cè)定空腹體重。計(jì)算食物效應(yīng)比（攝入每克食物造成的體重增加）。食物效應(yīng)比計(jì)算公式如下：

1.6 大鼠肝臟病理觀察

經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察組織病變情況。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）均由 7020型全自動(dòng)生化分析儀一同測(cè)定；肝臟超氧陰離子自由基、羥基自由基、一氧化氮自由基（NO）、過(guò)氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）均按照試劑盒提供的方法測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌及其發(fā)酵乳對(duì)大鼠體重及飲食量的影響

益生菌對(duì)大鼠飲食量及體重的影響如圖1所示。

圖1 益生菌對(duì)大鼠飲食量及體重的影響（n=10）Fig.1 Effect of probiotics on food intake and body weight of rats（n=10）

由圖1可以看出，大鼠對(duì)低脂飼料的攝入要高于高脂飼料，這是因?yàn)榈椭暳系哪芰棵芏缺容^低。益生菌發(fā)酵乳L(zhǎng)V108組和混合組消耗的飼料與模型組消耗的飼料無(wú)顯著性差異，表明益生菌的干預(yù)并沒有影響食物的攝入。第4周益生菌干預(yù)后，益生菌LV108組和混合組大鼠體重增加的速率較模型組相比明顯減緩，最終體重都顯著低于模型組（P＜0.05），說(shuō)明益生菌干預(yù)能夠減緩大鼠體重的增加。如表1所示，兩組益生菌干預(yù)組的食物效應(yīng)比也顯著低于模型組（P＜0.05）。

表1 益生菌對(duì)大鼠體重的影響（n=10）Table 1 Effects probiotics on weight parameters of rats（n=10）

2.2 益生菌及其發(fā)酵乳對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響

益生菌對(duì)大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影響如圖2所示。

圖2 益生菌對(duì)大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影響（n=10）Fig.2 Effects of probiotics on serum TC、TG、HDL-C and LDL-C levels in rats（n=10）

由圖2結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C與空白組相比均顯著增高（P＜0.05），分別增加了68.90%，21.61%，82.14%；HDL-C含量明顯降低（P＜0.05），較空白組降低了27.08%，說(shuō)明高脂飲食模型造成了大鼠脂質(zhì)代謝平衡被破壞，產(chǎn)生過(guò)多的脂肪酸，從而使血清中的TG、TC水平升高，肝臟脂肪酶加速清除HDL，使HDL-C含量降低，LDL-C含量升高。益生菌干預(yù)后，與模型組相比，LV108組與混合組大鼠血清的 TG、TC、LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）；HDLC顯著升高（P＜0.05）。其中，TG降低最明顯，LV108組和混合組分別降低了35.49%，36.59%。但與空白組比較，LV108組與混合組大鼠的TC、TG、LDL-C仍然有所升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而HDL-C顯著降低（P＜0.05）。

2.3 益生菌及其發(fā)酵乳對(duì)大鼠肝臟病變情況的影響

大鼠肝臟HE染色觀察如圖3所示。

圖3 大鼠肝臟HE染色觀察（×200）Fig.3 H&E staining of mouse liver（×200）

由圖3可知，空白組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核位于中央，未見脂肪空泡。模型組大鼠肝臟肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙不清，脂肪沉積明顯，肝組織小泡性脂肪變性及水樣變性，可見大量肝細(xì)胞脂肪空泡。益生菌干預(yù)后，肝臟細(xì)胞的脂肪變性減輕，肝細(xì)胞脂肪空泡減少，且空泡更小。病理學(xué)研究的結(jié)果同血清反映的情況一致，說(shuō)明益生菌干預(yù)能夠改善肝臟脂肪變性，對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷具有拮抗效應(yīng)。

2.4 益生菌及其發(fā)酵乳對(duì)大鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響

益生菌對(duì)大鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響如表2所示。

由表2結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平與空白組相比顯著升高（P＜0.05），分別增加了 73.18%、24.35%、100%和37.93%；而SOD、GSH、GSH-Px、CAT水平顯著降低（P＜0.05），分別降低了 45.26%、31.67%、13.17%和39.85%。在益生菌干預(yù)以后，與模型組相比，LV108組和混合組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平均顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH、GSH-Px、CAT 水平顯著升高 （P＜0.05），其中LV108組對(duì)SOD、GSH和CAT的影響較大，較模型組分別增加了42.87%、32.93%和44.76%，而混合組對(duì)抗氧陰離子自由基、GSH和CAT的影響較大，較模型組抗氧陰離子自由基減少了30.36%，GSH和CAT分別增加了35.98%和53.68%。兩組益生菌組干預(yù)效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但與空白組相比，LV108組和混合組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平仍然有所升高，SOD、GSH、GSH-Px、CAT水平有所降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 益生菌對(duì)大鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響（n=10）Table 2 Effects of probiotics on hepatic oxidants and antioxidants levels in rats（n=10）

3 討論

本研究旨在探究益生菌對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)氧化損傷的拮抗效應(yīng)機(jī)制。我們應(yīng)用高脂飲食成功誘導(dǎo)大鼠建立脂質(zhì)氧化損傷模型，結(jié)果也顯示了模型組大鼠與正?？瞻捉M大鼠相比出現(xiàn)了體重升高，血脂水平增高，光鏡下可見肝臟病理切片肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，脂肪沉積明顯，可見大量肝細(xì)胞脂肪空泡。

益生菌干預(yù)有效的控制了血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。國(guó)內(nèi)外的研究也發(fā)現(xiàn)益生菌可以降低血脂水平，并提高HDL-C水平[18-19]。同時(shí)，血脂水平在一定程度上能夠反映肝臟的損傷程度，間接說(shuō)明了益生菌干預(yù)能夠拮抗肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

此外，有研究報(bào)道了益生菌通過(guò)減少大鼠對(duì)高脂飲食中脂肪吸收來(lái)抑制血清TG和TC水平的增加[20-21]。益生菌對(duì)大鼠飲食量并沒有顯著影響，在相同的食物攝入量下，益生菌的干預(yù)顯著降低了高脂飼料的食物效應(yīng)比，減少了高脂飲食中脂肪的吸收，從而減緩了大鼠體重的增加，降低了血清TG和TC的含量。

肝臟脂質(zhì)代謝平衡被破壞，最為常見的是發(fā)生膽固醇代謝紊亂，其代謝的穩(wěn)態(tài)依賴于膽固醇合成、吸收和排泄途徑。HDL能將外周細(xì)胞中游離膽固醇運(yùn)到周圍的組織中去，實(shí)現(xiàn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，排除多余的膽固醇[22]。益生菌干預(yù)顯著提高血清中HDL-C水平，加速了膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄，抑制了脂肪酸合成，也起到了降血脂的功效。

機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)或非酶系統(tǒng)產(chǎn)生大量的自由基（如氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基等），自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，消耗體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，并可引起生物膜損害、線粒體功能紊亂、ATP合成障礙等，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡[23-25]。丙二醛（MDA）作為自由基作用于脂質(zhì)產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，也是衡量機(jī)體自由基代謝的敏感指標(biāo)，可間接反映肝臟細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[26]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸結(jié)合而成的小分子三肽化合物，是機(jī)體重要的抗氧化劑和自由基清除劑[27]。SOD、CAT和GSH-Px都是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們可以消除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫及脂質(zhì)過(guò)氧化物[28]。SOD是機(jī)體清除超氧陰離子自由基最主要的酶。CAT主要存在于過(guò)氧化物酶體，清除機(jī)體過(guò)多的過(guò)氧化氫[29]。GSH-Px是一種以GSH為底物的重要抗氧化酶，通過(guò)保護(hù)機(jī)體免受H2O2造成的傷害，能降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度[30]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平顯著升高，而 GSH、SOD、CAT、GSH-Px水平顯著降低，說(shuō)明高脂飲食造成了肝細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。在在益生菌干預(yù)以后，大鼠肝臟抗氧陰離子自由基、羥自由基、NO自由基和MDA水平均有所降低，GSH、SOD、CAT、GSH-Px水平升高，說(shuō)明益生菌可有效提高大鼠體內(nèi)部分抗氧化酶活力和非酶抗氧化物質(zhì)的含量，清除自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，緩解肝臟受損的程度，有效對(duì)抗大鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

益生菌通過(guò)降低高脂飼料的食物效應(yīng)比，緩解脂質(zhì)堆積，調(diào)控血脂水平，維持大鼠體內(nèi)部分抗氧化酶的活力和非酶抗氧化物質(zhì)的水平，清除過(guò)氧化自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的形成，拮抗肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，緩解肝臟受損的程度，減輕肝臟炎癥。但為進(jìn)一步明確益生菌對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷拮抗機(jī)制，需后期從分子水平作深入研究。

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