張勃，趙春海，霍寧波

（1.乳山市漁政監(jiān)督管理站，山東威海264500；2.濱州職業(yè)學(xué)院，山東濱州256603）

隨著世界環(huán)境污染的日益嚴(yán)重和能源危機(jī)的不斷加劇，節(jié)能環(huán)保的科技項(xiàng)目日益受到重視，結(jié)合我國在全國范圍內(nèi)推行新舊動能轉(zhuǎn)換，提升企業(yè)發(fā)展的科技水平。根據(jù)目前淀粉的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍分析，低溫淀粉酶可以在生產(chǎn)中替代中溫和高溫淀粉酶的應(yīng)用領(lǐng)域，同時降低反應(yīng)條件，避免了在酶解中對生產(chǎn)原料和其中不耐高溫物質(zhì)的破壞同時低溫淀粉酶的工作環(huán)境也在一定程度上降低了對溫度即能源的需求，使得低溫淀粉酶在大規(guī)模生產(chǎn)領(lǐng)域優(yōu)勢明顯，同時低溫淀粉酶的活性條件容易實(shí)現(xiàn)，在環(huán)境處理中是一種高效生物治理方法[1]。

淀粉酶在以糖為原料的工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛，可應(yīng)用于多種酒類及酒精發(fā)酵，發(fā)酵食品中的催熟劑和動物飼養(yǎng)等行業(yè)。同時糖化酶在輕工、食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價值，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。隨著研究的深入對其酶學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理、結(jié)構(gòu)功能相關(guān)性等問題有了一定的了解，其應(yīng)用領(lǐng)域和范圍更加廣泛[3-4]。

基于黃河三角洲區(qū)域特點(diǎn)，蘊(yùn)育著獨(dú)特的微生物資源，為了充分開發(fā)和利用本地區(qū)的微生物資源，發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶，有利于拓寬低溫淀粉酶的生產(chǎn)來源，豐富低溫淀粉酶家族成員，有利于對低溫淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，不論是應(yīng)用還是理論研究都具有重要意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 采樣及菌種

樣品：濱州本地區(qū)土樣、水樣。

1.2 試劑

1）0.1 mol/L醋酸緩沖溶液（pH5.0～6.0）。

2）Somogyi氏試劑（酒石酸鉀鈉、Na2CO3、NaHCO3、CuSO4、鉬酸銨、砷酸氫二鈉）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

GTR16-2高速低溫離心機(jī)：北京時代北利離心機(jī)有限公司；FA1004B電子分析天平：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；CX21BIM-SET5顯微鏡：上海譜騫光學(xué)儀器有限公司；T6紫外分光光度計：上海添時科學(xué)儀器有限公司；ABI-2720PCR 儀：Applied Biosystems，美國。

1.4 培養(yǎng)基

平板篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH自然，115℃滅菌，30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，可溶性淀粉1%，蛋白胨2%，酵母粉1%，瓊脂2%，pH自然，115℃滅菌30 min。

1.5 菌種的分離與篩選

1.5.1 菌株的初篩

樣品→選擇性培養(yǎng)基平板分離→最適生長溫度測定→搖瓶篩選→菌株獲得→酶活測定[2]

1.5.2 菌株的復(fù)篩

初篩的純菌種培養(yǎng)于250 mL三角瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基72 h，進(jìn)行酶活測定。

1.5.3 粗酶分離及酶活測定

淀粉酶活力測定是通過測定還原糖的增加進(jìn)行測定。將經(jīng)過震蕩培養(yǎng)48 h后的發(fā)酵液離心，收集上清液測定酶活。將用醋酸緩沖溶液（pH5.0）制備的淀粉溶液作為底物。按照粗酶液與底物體積比1∶10比例混勻，50℃水解30 min后沸水浴中5 min終止反應(yīng)。以Nelson—Somogyi方法測定還原糖濃度。酶解產(chǎn)生1.0 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活性單位（U/mL）[5]。

1.5.4 最適溫度的選擇

將分離的菌種接種在篩選平板上，將平板放置于不同溫度條件下培養(yǎng)，3 d～4 d后觀察，并在生長較為理想的平板上滴加碘液，根據(jù)顯色挑出菌落在35℃繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)水解圈直徑和菌落直徑比值，確定發(fā)酵復(fù)篩的菌株。

1.5.5 菌種的鑒定[5]

1.5.5.1 形態(tài)觀察

通過菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。

將平板分離的單個菌落通過電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀、大小、繁殖方式。

1.5.5.2 糖發(fā)酵測試

選擇葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖和棉子糖進(jìn)行試驗(yàn)。將質(zhì)量體積百分含量為10.0%的糖溶液10 mL裝在管中滅菌后使用，用注射器去定量的糖液分裝于杜氏管，接種于試管中25℃～28℃下培養(yǎng)觀察。菌種發(fā)酵糖后產(chǎn)氣就會在杜氏小管頂端出現(xiàn)空管現(xiàn)象，既可以判定為陽性（+），反之為（-）。

1.5.5.3 碳源同化

測試碳源選擇葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、纖維二糖、海藻糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、山梨糖和可溶性淀粉等。將菌種分別接種在含有0.5%唯一同化碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，25℃～28℃下培養(yǎng)，以葡萄糖和不加任何碳源的空白分別作對照，凡是能生長的判定為陽性（+），反之為陰性（-）[5]。

1.5.5.4 分子生物學(xué)鑒定

通過分離菌株的基因組中ITS測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對與分析，并進(jìn)行進(jìn)化樹繪制。

1.5.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

進(jìn)行菌種生長規(guī)律的測定，單因子發(fā)酵條件試驗(yàn)，并進(jìn)行菌種產(chǎn)酶時間的探索研究。

2 結(jié)果

2.1 菌種的分離結(jié)果

2.1.1 平板菌落與淀粉水解

將初篩菌株分別接種在含有淀粉的平板上，28℃培養(yǎng)觀察淀粉水解情況，結(jié)果如圖1～圖2所示。

圖1 菌株Bz-11與Bz-25菌落與水解圈Fig.1 The colony and hydrolytic circle of Bz-11and Bz-25

圖2 Bz-38與Bz-73菌落與水解圈Fig.2 The colony and hydrolytic circle of Bz-38 and Bz-73

圖1、圖2中分離的不同菌株在固體平板上都出現(xiàn)了水解圈，證明這些菌株可以生產(chǎn)胞外淀粉酶，但是菌株是否同時可以合成胞內(nèi)淀粉酶、而且這些胞外酶是否為低溫淀粉酶還需要進(jìn)一步驗(yàn)證[7-8]。

部分初篩菌株在不同生長溫度的透明圈與菌落直徑比值見表1。

表1 不同菌株在不同溫度下水解圈與菌落直徑比值Table1 The ratio of hydrolytic circle to colony diameter from different strains at different temperatures

由表1 可知，Bz38 酶活最高，Bz11、Bz25、Bz38、Bz73相似；這些菌最適生長溫度均在20℃左右，較常規(guī)報道使用的產(chǎn)酶微生物的培養(yǎng)溫度低，與文獻(xiàn)報道的產(chǎn)低溫淀粉酶的低溫微生物生長溫度一致[9]。

2.1.2 發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果

經(jīng)過初篩得到 Bz11、Bz25、Bz38、Bz73，根據(jù)水解圈與菌落直徑比值，選擇了其中Bz11、Bz38兩株相對較高菌株在20℃搖瓶液體發(fā)酵48 h，取發(fā)酵液離心后收集上清液即為粗酶液，進(jìn)行酶活測定，結(jié)果如表2所示。

表2 2菌株發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果Table 2 Rescreening results of strain fermentation

搖瓶液體發(fā)酵酶活分別為590 U/mL和660 U/mL，從平板固體培養(yǎng)與搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)都證明了Bz38菌株產(chǎn)酶活性較高，因此選擇野生型菌株Bz38作為產(chǎn)酶試驗(yàn)對象，進(jìn)行鑒定與發(fā)酵研究。

為了驗(yàn)證淀粉酶的水解作用，分別以單糖、二糖、三糖為對照，以淀粉水解液為待測樣品，進(jìn)行層析色譜分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 葡萄糖淀粉酶酶解淀粉層析圖Fig.3 The chromatography from glucoamylase hydrolyzed starch

由圖3可知，淀粉酶水解層析試驗(yàn)，通過層析結(jié)果表明，分離菌株產(chǎn)生的淀粉酶可以將淀粉水解成不同大小分子[10-11]。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 生理和生化鑒定

將分離菌株劃線于平板上，進(jìn)行菌落觀察如圖4（A）所示，菌落表明光滑、整齊、濕潤成乳白色；將分離菌株細(xì)胞在顯微鏡下觀察圖4（B）所示，部分細(xì)胞呈現(xiàn)大小兩個連在一起的現(xiàn)象，典型酵母菌出芽生殖特征。

圖4 Bz38菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Bz38 colony morphology and cell morphology

酵母菌生理生化特性鑒定指標(biāo)有碳源發(fā)酵測試、碳源同化、本試驗(yàn)篩選葡萄糖、麥芽糖等7種糖進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)（表3），選擇葡萄糖、麥芽糖等12種糖進(jìn)行碳源同化試驗(yàn)，結(jié)果見表3和表4。

表3 酵母菌BZ38的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of BZ38 sugar fermentation test

表4 產(chǎn)酶菌株BZ38碳源同化試驗(yàn)Table 4 Carbon source assimilation test of strain Z38

酵母菌BZ38不能發(fā)酵利用常見糖類（表3），但是可以通過同化方式利用葡萄糖糖、麥芽糖、蔗糖（表4）等，與常見酵母菌碳源發(fā)酵、碳源同化結(jié)果一致。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步掌握確定菌株的分離地位，提取酵母BZ38菌株的基因組DNA，如圖5所示，平行提取5組進(jìn)行電泳檢測，并通過酵母通用引物測定了其26S rDNA序列結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增片段大小為500 bp左右。將這個序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中其它酵母菌的26S rDNA序列進(jìn)行比[5]。

圖5 BZ38基因組DNA（1kb maker）Fig.5 The genome DNA of BZ38（1kb maker）

圖6 26SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（D2000maker）Fig.6 PCR amplification results from 26SrDNA（D2000maker）

為了進(jìn)一步確定分離獲得的菌株B38在微生物中的分類地位，在NCBI數(shù)據(jù)庫和CBS菌種庫中尋找出各個物種菌株的rDNA序列，與菌株的ITS序列經(jīng)比對后，用MEGA6.0軟件通過Neughbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖7。

圖7 菌株BZ38 26S rDNA序列進(jìn)化樹結(jié)果Fig.7 Sequence evolution tree results of strain BZ38 26S rDNA

通過與已知鑒定的酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落和細(xì)胞形態(tài)相比，菌株BZ38解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）接近，通過ITS序列進(jìn)行比對與進(jìn)化樹的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了形態(tài)與生理生化方法對株菌的鑒定，BZ38與解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）親緣關(guān)系最為相近，下一步研究以BZ38為研究對象[12-13]。

2.3 發(fā)酵條件試驗(yàn)

2.3.1 生長曲線的測定

生產(chǎn)曲線是單細(xì)胞微生物特有的生長規(guī)律，為了準(zhǔn)確掌握BZ38生長階段規(guī)律變化，進(jìn)行了生長曲線的測定，結(jié)果如圖8所示。

圖8 Bz38菌株成長曲線Fig.8 Growth curve of Bz38 strain

對菌種Bz38在YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行了生長曲線的測定，從圖8可以看出生長規(guī)律基本符合單細(xì)胞微生物群體生長規(guī)律，生長曲線表明菌體12 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，為進(jìn)一步發(fā)酵條件的優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

2.3.2 單因子試驗(yàn)

2.3.2.1 碳源對產(chǎn)酶發(fā)酵的影響

在只改變原培養(yǎng)基碳源的情況下，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇5種糖做單一碳源時，濃度分別選10、15、20 g/L 3個濃度，考查不同碳源對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同碳源條件對比酶活的影響Table 5 Effects of different carbon source conditions on enzyme activity

由表5可知，以酶OD值為主要指標(biāo)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示蔗糖酶為碳源時酶活性較大，其次是葡萄糖，麥芽糖、乳糖、甘露醇3種物質(zhì)為碳源產(chǎn)酶時，酶濃度較低。結(jié)果也表明碳源對Bz38 Yarrowia lipolytica發(fā)酵的淀粉酶有很大影響[14]。

不同碳源種類試驗(yàn)中也表明同一種碳源不同濃度也會對酶活產(chǎn)生影響，選擇了對酶活影響比較大的蔗糖和葡萄糖進(jìn)行試驗(yàn)見圖9。

圖9 兩種碳源不同濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of different concentrations of two carbon sources on enzyme production

由圖9所示，在一定濃度范圍內(nèi)隨著碳源濃度增加，酶活力也隨之提高，到了30 g/L，酶活性開始降低，可能是高濃度的糖，增加了發(fā)酵液的濃稠度，影響了菌體對氧氣的利用，進(jìn)而影響酶的合成和活性，補(bǔ)料發(fā)酵可以避免上述情況的發(fā)生。蔗糖對應(yīng)的酶活比葡萄糖的高，成本又低，應(yīng)選擇蔗糖?？紤]到20 g/L與25 g/L的酶活差不多，為了節(jié)省成本，所以選擇20 g/L蔗糖。

2.3.2.2 氮源對產(chǎn)酶發(fā)酵的影響

有機(jī)氮源來源充足，但是微生物生長和很多大分子物質(zhì)合成所必需，又是在酶代謝合成中，雖然有機(jī)氮源被微生物利用緩慢，但對培養(yǎng)基組成意義重大。

通過搖瓶試驗(yàn)已初步確定出碳源，所以把此試驗(yàn)結(jié)果用于優(yōu)化氮源的試驗(yàn)中，即碳源改為25 g/L蔗糖。在選擇有機(jī)氮源的試驗(yàn)中，分別選用了牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、尿素、酪蛋白胨、硫酸銨6種有機(jī)氮源。試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 不同氮源對酶活的影響Table 6 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity

從表6可以看出，選擇酵母膏、牛肉膏作為氮源時酶活相對較高，其它幾種有機(jī)氮源的酶活較低，確定酵母膏為有機(jī)氮源，同時考慮到微生物對氮源的利用分為遲效率氮源，和速效氮源，進(jìn)一步增加硫酸銨作為下一步有機(jī)氮源配合使用的備選氮源。

3 結(jié)論

通過對黃河三角洲地區(qū)的土樣中微生物的采集、分離獲得了4株產(chǎn)葡萄糖淀粉較高的菌株：Bz11、Bz25、Bz38、Bz73，經(jīng)過復(fù)篩最終選擇產(chǎn)酶相對較高的Bz38作為研究對象進(jìn)行研究，通過平板菌落觀察、顯微鏡細(xì)胞觀察，碳源發(fā)酵與同化試驗(yàn)、26srDNA分子生物學(xué)鑒定，最終確定為Bz38為解脂亞羅酵母菌。通過生長曲線測定掌握菌株生長規(guī)律的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因子碳源、氮源試驗(yàn)酶活達(dá)到960 U/mL，為全面應(yīng)用葡萄糖淀粉酶奠定了堅實(shí)的力量基礎(chǔ)，也極大的豐富了本地區(qū)對微生物種植資源的開發(fā)和利用。

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