（寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏銀川750001）

豆芽是深受廣大消費(fèi)者歡迎的食品，具有較高的營養(yǎng)價值。近年來，市場上曝光市場豆芽存在質(zhì)量安全隱患[1-3]，同時在執(zhí)法檢查中發(fā)現(xiàn)部分豆芽生產(chǎn)者為縮短生產(chǎn)周期、增加產(chǎn)量、改善豆芽外觀，在生產(chǎn)黃豆芽、綠豆芽、豆苗的過程中非法添加“AB粉”、“無根豆芽素”等化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)象，濫用的植物生長調(diào)節(jié)劑會給健康帶來風(fēng)險，已成為目前食品安全領(lǐng)域的一個重大問題[4]。國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2015年11號公告明確規(guī)定在豆芽生產(chǎn)過程中不得使用4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素等物質(zhì)。

目前，國內(nèi)外有關(guān)4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、赤霉素等物質(zhì)檢測方法主要以氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]和色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]為主。不同的檢測方法具有其特定的優(yōu)缺點(diǎn)：運(yùn)用氣相色譜法（gas chromatography，GC）和氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）時通常要進(jìn)行衍生化的復(fù)雜操作，且存在定性不足和靈敏度低等問題；液相色譜法不需要衍生處理，但同樣存在選擇性差、靈敏度低、易受復(fù)雜樣品基質(zhì)干擾且難以實現(xiàn)確證分析等問題。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）具有高特異性和高靈敏度，是目前廣泛應(yīng)用的檢測方法。本試驗通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件，考察流動相、提取方法和基質(zhì)效應(yīng)等因素，建立HPLC-MS/MS法結(jié)合分散萃取技術(shù)同時測定豆芽中4種藥物殘留，該方法準(zhǔn)確可靠，回收率穩(wěn)定，能滿足日常豆芽藥物殘留的檢測要求。為嚴(yán)厲打擊豆芽違法添加禁限用物質(zhì)的行為，實現(xiàn)對豆芽生產(chǎn)及市場的有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆芽：市售。

赤霉素（gibberellic acid，GA3）、6-芐基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-AB）、4-氯 苯 氧 乙 酸 （4-chlorophenoxyacetic acid，4-CPA）、2，4- 滴 （2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）：德國 Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于98%；甲醇、乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；C18、硫酸鎂：適用于QuEChERS方法的填料，美國安捷倫公司；甲酸（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級純）、冰乙酸（優(yōu)級純）：德國SIGMA公司；氯化鈉（優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有用水均為超純水。

Aglient6460三重四級桿質(zhì)譜：配Aglient 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；IKA T25數(shù)顯型分散機(jī)：德國IKA公司；BUCHI V-850旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦實驗室公司；BS224電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器公司；HGC-24方形干式加熱氮吹儀：北京恒奧德儀器儀表有限公司；3-15高速離心機(jī)：德國Sigma公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量用空白基質(zhì)提取液稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 試樣制備

取200 g左右樣品加入等質(zhì)量的去離子水，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)并混合均勻后，應(yīng)立即測定。

1.3.2 試樣溶液的制備

稱取混合均勻的豆芽樣品10 g（精確至0.01 g）于100 mL離心管中，加入15 mL 5%乙酸乙腈，渦旋混勻，10 000 r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿1 min。在4℃條件下8 000 r/min冷凍離心5 min，上清液備用。

1.3.3 凈化

準(zhǔn)確稱取0.15 gC18和0.90 g硫酸鎂于15 mL離心管中，渦旋混勻。加入5.0 mL上清液，渦旋1 min，去除雜質(zhì)，在4℃條件下8 000 r/min冷凍離心5 min。取出后放置室溫，再取上清液1.0 mL于50℃下氮吹至干，準(zhǔn)確加入1.0 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1（內(nèi)徑）mm 100 mm，粒徑 3.5 μm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30.0 ℃；流速：0.30 mL/min；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨-0.05%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for linear gradient elution

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：AJS ESI源；掃描方式；負(fù)模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reactions monitoring，MRM）；霧化氣壓力：3.1 bar；噴嘴電壓：500 V；干燥氣溫度與流速：325℃，7 L/min；鞘氣溫度與流速：375℃，11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 000 V。豆芽中4種藥物殘留的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)見表2。

表2 豆芽中4種添加物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS/MS parameters for four additives in bean sprouts

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于4-氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸和赤霉素的分子結(jié)構(gòu)中均含有羧基；6－芐氨基嘌呤可產(chǎn)生[M+H]＋離子，也可以形成穩(wěn)定的[M+H]－離子。因此采用負(fù)離子方式對4種添加物進(jìn)行電離。分別對濃度為1.0 μg/mL的目標(biāo)化合物進(jìn)行單針進(jìn)樣，優(yōu)化其質(zhì)譜條件。當(dāng)目標(biāo)化合物進(jìn)入一級質(zhì)譜后，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]離子[10]。確定母離子后，在SIM模式下優(yōu)化各目標(biāo)化合物的碎裂電壓。母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜，產(chǎn)生不同的離子碎片。在子離子掃描模式下，優(yōu)化碰撞能量，得到相應(yīng)的離子碎片。4種添加物的二級離子質(zhì)譜圖見圖1，MRM色譜圖見圖2。

圖1 豆芽中4種添加物的二級離子質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectra for four additives in bean sprouts

圖2 豆芽中4種添加物的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms for four additives in bean sprouts

2.2 色譜條件優(yōu)化

赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴在不同的流動相中分離程度不同，對比3種流動相甲酸水溶液、乙酸銨水溶液、乙酸銨-甲酸水溶液。通過試驗，各待測物在乙酸銨-甲酸水溶液流動相中的分離程度及峰形較好。因此選擇5 mmol/L乙酸銨-0.05%甲酸水溶液和乙腈為流動相；在ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱通過梯度洗脫對4種添加物進(jìn)行分離，目標(biāo)化合物的保留時間為2 min～7 min之間。

2.3 樣品前處理條件的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇

對比乙腈、含2%乙酸乙腈、含5%乙酸乙腈3種溶液作為提取溶劑時，各待測物的回收率。其中含5%乙酸乙腈溶液做為提取溶劑時，回收率最高。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化

分別在 MgSO4+C18、C18+PSA、MgSO4+C18+Carbon 3種凈化條件下進(jìn)行試驗，不同凈化材料可以選擇性地保留基質(zhì)干擾成分，達(dá)到凈化效果。但使用PSA和Carbon時對目標(biāo)物也有一定的吸附，回收率偏低。最終采用MgSO4+C18作為凈化劑時，各待測物的回收率較高。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是在提取基質(zhì)中的目標(biāo)物時，基質(zhì)中的干擾物影響目標(biāo)化合物的離子化，使得目標(biāo)化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生了增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象[11]，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性?？疾?種化合物在豆芽中均為基質(zhì)抑制效應(yīng).為提高目標(biāo)化合物測定的準(zhǔn)確度，本方法使用空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低基質(zhì)干擾的影響。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

將 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L 系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴在1.0 μg/L～200.0 μg/L的范圍內(nèi)，其濃度與各待測物的峰面積呈良好的線性關(guān)系。4種添加物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限（信噪比S/N≥3）見表3。

表3 豆芽中4種添加物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 3 Linear equation，coefficient correlation，linear range，LODs of four additives in bean sprouts

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

由寧夏食品檢測中心自制3種不含目標(biāo)化合物的豆芽（黃豆芽、綠豆芽、扁豆芽）作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，添加水平分別為0.045、0.090、0.15 mg/kg進(jìn)行測定，其中赤霉素的回收率范圍為68.9%～115.2%；6-芐基腺嘌呤的回收率范圍為68.1%～105.8%；4-氯苯氧乙酸的回收率范圍為75.3%～119.0%、2，4-滴的回收率范圍為63.8%～102.6%。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.94%～12.34%，其精密度符合方法學(xué)的要求。赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴添加濃度及回收率的數(shù)據(jù)見表4。

表4 赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴的回收率及精密度試驗Table 4 The recovery and precision experiment for four additives in bean sprouts

2.7 樣品測定

本方法對市售豆芽進(jìn)行測定。隨機(jī)采購市售黃豆芽、綠豆芽、扁豆芽各10個批次，其中9個批次未檢出，一個批次黃豆芽中檢出4-氯苯氧乙酸。樣品圖譜見圖3。

圖3 黃豆芽樣品色譜圖Fig.3 MS/MS spectra for four additives in Soybean sprouts

3 結(jié)論

建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合分散固相萃取技術(shù)，同時測定豆芽中赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2，4-滴殘留的分析方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，能夠滿足豆芽中4種藥物殘留的定性和定量分析。

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