楊淑君，何永攀，柯 梅，李 莉，梁維維，侯鈺榮

（新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830000）

生物固氮主要是指利用能夠消化分解氮元素的有益微生物，通過(guò)微生物體內(nèi)酶的一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)之后，將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨根離子，從而被植物根系更好的吸收和利用。生物固氮是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中氮元素利用的重要組成部分。生物固氮對(duì)反應(yīng)條件要求不高，通常在室溫環(huán)境下就能進(jìn)行，它能夠?qū)⒖諝庵械牡厥紫冗€原成氨氣，然后氨氣和水分接觸后形成氨水，進(jìn)入土壤后，以銨根離子被作物吸收。而傳統(tǒng)化肥制備過(guò)程中利用氮?dú)夂铣煞柿希枰邷馗邏簵l件下才能進(jìn)行，資源消耗量較高，并且在生產(chǎn)過(guò)程中很容易對(duì)環(huán)境造成污染。在自然系統(tǒng)中固氮形式主要有兩種，第一種是微生物自行固氮，是指微生物不需要借助在其它動(dòng)物和植物體內(nèi)而進(jìn)行的一種獨(dú)立固氮模式。另一種是指固氮微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中必須和其他植物有效結(jié)合在一起，以植物為寄生場(chǎng)所，通過(guò)根系作用，為有益微生物獲得更多氧氣，在充足氧氣供給下，固氮微生物可以將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨氣，供植物利用。共生固氮模式中氮元素扮演著十分重要的角色。而紫花苜蓿是多年生的草本植物，抗寒抗旱能力強(qiáng)，耐貧瘠，種植范圍廣泛，是世界種植范圍最廣的豆科類牧草。該種牧草產(chǎn)量高，適口性好，品質(zhì)優(yōu)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都很高。紫花苜蓿不僅具有很強(qiáng)的固氮能力，而且具有發(fā)達(dá)的根系，對(duì)保持水土，避免水土污染具有積極作用。

1 材料和方法

1.1 一般材料選取

1.1.1 培養(yǎng)基選擇

本次研究過(guò)程中，主要選擇了YMA培養(yǎng)基TY液體培養(yǎng)基，Gibson微量元素液，F(xiàn)ahraeus無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液。供試菌株主要選擇由黑龍江生物有機(jī)肥工程技術(shù)研究中心提供的HLJ30、HLJ32、HLJ35、HLJ37、HLJ38、HLJ39、HLJ40、HLJ41根瘤菌菌株，寄主主要是紫花苜蓿。本次研究中選擇了兩種基質(zhì)，分別為風(fēng)化煤和蛭石。

1.1.2 苜蓿品種選擇

紫花苜蓿品種由新疆自治區(qū)草原管理站提供，選擇從國(guó)外引進(jìn)的抗逆性較強(qiáng)的紫花苜蓿品種巨人201，該品種來(lái)自于美國(guó)，休眠級(jí)數(shù)2.0，發(fā)芽率在94%以上，抗寒性能極強(qiáng)，是寒冷地區(qū)表現(xiàn)較佳的一種紫花苜蓿引進(jìn)品種。

1.1.3 藥品與儀器

試劑有鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、磷酸鈉磷酸二氫鉀、氯化鈉、二水硫酸鈉、磷酸鉀、95%、乙醇、甲烯藍(lán)、甲基紅、硼酸、瓊脂粉，胰蛋白胨、酵母粉、硫酸銅、七水高錳酸鈉、七水硫酸鎂、檸檬酸鐵等均為國(guó)產(chǎn)分析純；其次，試驗(yàn)儀器選擇。本次研究過(guò)程中，試驗(yàn)儀器主要涉及氣相色譜、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、垂直流超凈工作臺(tái)、顯微鏡、紫外線分光光度計(jì)、PH計(jì)、20孔消煮爐、生化培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先，在風(fēng)化煤和蛭石兩種不同的種植基質(zhì)中，將本次研究所選擇的紫花苜蓿品種用八種不同的根瘤菌菌株進(jìn)行有效處理，同時(shí)設(shè)置不經(jīng)過(guò)菌種處理的對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)三次；其次，基質(zhì)處理。將蛭石和風(fēng)化煤兩種基質(zhì)分別用營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理，然后將處理得到的基質(zhì)放入到容器中進(jìn)行高溫滅菌處理。在121℃條件下，濕熱滅菌處理1 h后備用；再次，紫花苜蓿種子催芽。選擇顆粒飽滿，無(wú)明顯機(jī)械損傷、病蟲(chóng)害危害的紫花苜蓿種子。先將紫花苜蓿種子使用濃度為75%的酒精溶液消毒6 min，然后使用蒸餾水清洗紫花苜蓿種子5～6次，使用次氯酸鈉再次對(duì)種子進(jìn)行全面消毒，然后再使用蒸餾水清洗5～6次。

將經(jīng)過(guò)處理后的種子均勻的放在1%的瓊脂平板上，28℃度恒溫箱黑暗培養(yǎng)36 h，等到紫花苜蓿根長(zhǎng)到1～2 cm時(shí)即可以接種根瘤菌；最后根瘤菌接種。在培養(yǎng)皿中加入制備好的菌懸濁液，再加入適量的催好芽的苜蓿種子，作用15 min后用無(wú)菌鑷子取苜蓿種子裝入無(wú)菌基質(zhì)的塑料杯中，每個(gè)處理種植3株，然后再向植株根部加入制備好的菌液5 mL，晝夜溫度維持在23℃，日照小時(shí)數(shù)控制在16 h。培養(yǎng)60 d后開(kāi)始收獲紫花苜蓿，測(cè)定紫花苜蓿株高、干物質(zhì)以及全氮含量。

1.2.2 植物樣品分析

首先，植物干重測(cè)定。以第一片葉子葉痕處作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，將培養(yǎng)好的紫花苜蓿地上部分刈割后在80℃溫度下烘干稱量干重；其次，紫花苜蓿全氮含量測(cè)定。全氮含量測(cè)定，采用凱氏定氮法測(cè)定總氮含量。總氮含量等=[（滴定樣樣品時(shí)消耗鹽酸的含量-滴定空白對(duì)照用去鹽酸的含量）×標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)×14×6.25]/（測(cè)定樣品干重×1 000）×100；最后，株高測(cè)定。從子葉痕跡處到距離生長(zhǎng)點(diǎn)最近的展開(kāi)葉頂端。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次研究過(guò)程中，采用DPS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛭石栽培試驗(yàn)

2.1.1 紫花苜蓿根瘤菌結(jié)瘤情況

通過(guò)對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析接種根瘤菌后，能夠顯著提高雌花苜蓿根部的結(jié)瘤能力，巨人201品種接種根瘤菌后，根瘤數(shù)量和對(duì)照組相比差異性顯著，其中增長(zhǎng)最多的是HLJ32，增長(zhǎng)了3570.72%，增長(zhǎng)最少的是HLJ41相比對(duì)照組僅增長(zhǎng)了636.62%。通過(guò)以上數(shù)據(jù)分析可以看出，同一個(gè)苜蓿品種接種不同根瘤菌，其結(jié)瘤效果也存在一定差異性。

表1 紫花苜蓿品種接種不同根瘤的根部結(jié)瘤情況

2.1.2 紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌株高對(duì)比

通過(guò)對(duì)表2數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌對(duì)株高影響較大，紫花苜蓿接種同一個(gè)根瘤菌，差異性也比較顯著。巨人201接種不同根瘤菌后，增長(zhǎng)最顯著的是HLJ32，增長(zhǎng)率為88.50%。

表2 紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌株高對(duì)比

2.1.3 地上部分生物量比較

通過(guò)對(duì)表3數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌后，均能夠有效提高植株地上部分的干重，與紫花苜蓿巨人201匹配較好的菌種有HLJ35、HLJ37和HLJ38，這兩個(gè)菌種均能夠有效促進(jìn)紫花苜蓿地上部分生物量增長(zhǎng)，分別增長(zhǎng)了450.00%、455.56%和472.22%，詳細(xì)情況如表3所示。

表3 紫花苜蓿生物量比較

2.1.4 全氮含量比較

通過(guò)對(duì)表4數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿，通過(guò)菌種處理之后，全氮含量普遍高于對(duì)照組。接種了八種根瘤菌后，全氮含量差異性很大。HLJ35、HLJ37、HLJ38和對(duì)照組相比，差異性顯著，分別增長(zhǎng)了65.64%、78.84%、71.07%。

表4 全氮含量比較

2.2 風(fēng)化煤栽培試驗(yàn)

2.2.1 紫花苜蓿根瘤菌結(jié)瘤情況

通過(guò)對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌后，能夠顯著提高雌花苜蓿根部的結(jié)瘤能力，巨人201品種接種根瘤菌后，根瘤數(shù)量和對(duì)照組相比差異性顯著，其中增長(zhǎng)最多的是HLJ38，增長(zhǎng)了2 350.00%，增長(zhǎng)最少的是HLJ39相比對(duì)照組僅增長(zhǎng)了1 038.36%。通過(guò)以上數(shù)據(jù)分析可以看出，同一個(gè)苜蓿品種接種不同根瘤菌，其結(jié)瘤效果也存在一定差異性。

表5 紫花苜蓿品種接種不同根瘤的根部結(jié)瘤情況

2.2.2 紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌株高對(duì)比

通過(guò)對(duì)表6數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌對(duì)株高影響較大。巨人201接種根瘤菌后，增長(zhǎng)最顯著的是HLJ35，增長(zhǎng)率為80.73%。

表6 紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌株高對(duì)比

2.2.3 地上部分生物量比較

通過(guò)對(duì)表7數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)紫花苜蓿品種接種不同根瘤菌后，均能夠有效提高植株地上部分的干重，與紫花苜蓿巨人201匹配較好的菌種有HLJ37，這個(gè)菌種均能夠有效促進(jìn)紫花苜蓿紫花苜蓿生物量增長(zhǎng)，地上部分生物量增長(zhǎng)了704.76%。

表7 地上部分生物量比較

2.2.4 全氮含量比較

通過(guò)對(duì)表8數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿通過(guò)菌種處理之后，全氮含量普遍高于對(duì)照組。接種了八種根瘤菌后，全氮含量差異性很大。HLJ32、HLJ35、HLJ38和對(duì)照組相比差異性顯著，分別增長(zhǎng)了122.05%、135.43%、111.02%。

表8 全氮含量比較

3 討 論

研究采用了風(fēng)化煤和蛭石兩種基質(zhì)，進(jìn)行紫花苜蓿根瘤菌共生匹配試驗(yàn)。從本次研究的結(jié)果來(lái)看，從接種八種不同的根瘤菌所表現(xiàn)出來(lái)的接種效果，存在較大差異性。同一種紫花苜蓿接種不同種類根瘤菌并不能獲得同樣的效果，只有某種根瘤菌品種，能夠與紫花苜蓿表現(xiàn)出很好的共生關(guān)系，這種關(guān)系就說(shuō)明了在根瘤菌選擇過(guò)程中，一定要結(jié)合紫花苜蓿的需求綜合確定。只有做到這樣才能確保根瘤菌進(jìn)行有效固氮。試驗(yàn)中篩選出的各種匹配的共生根瘤菌來(lái)看，接種根瘤菌和不接種根瘤菌之間有著顯著差異，紫花苜蓿接種根瘤菌，能夠顯著提高紫花苜蓿的地上部分生物量，這說(shuō)明了根瘤菌在紫花苜蓿地上部分生長(zhǎng)中，扮演著十分重要的角色。尤其是在干旱、荒漠、貧瘠地區(qū)種植紫花苜蓿并接種相匹配的根瘤菌，對(duì)改良土壤，提高產(chǎn)量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境都具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

以蛭石和風(fēng)化煤作為基質(zhì)進(jìn)行根瘤菌與苜蓿品種共生匹配試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，接種根瘤菌都能夠顯著促進(jìn)紫花苜蓿根瘤數(shù)量、平均株高、生物量和全氮含量的增長(zhǎng)。從增長(zhǎng)數(shù)量來(lái)看，以風(fēng)化煤作為基質(zhì)，進(jìn)行根瘤菌和苜蓿品種之間匹配的固氮效果和生物量均高于另外一種基質(zhì)，由此可以將風(fēng)化煤作為選擇苜蓿根瘤菌菌種的優(yōu)先培養(yǎng)基質(zhì)。這與慈恩研究的不同環(huán)境因子對(duì)紫花苜蓿—根瘤菌共生體系的影響內(nèi)容基本一致。

本次試驗(yàn)過(guò)程，主要測(cè)定了植株的全氮含量、平均株高、地上部分干重、根瘤數(shù)量，這其中植株地上部分干種被普遍用作衡量苜蓿和根瘤菌之間共生效果的主要指標(biāo)。因此，在以上基質(zhì)中進(jìn)行共生匹配研究，可以用干重、全氮含量對(duì)根瘤菌的共生效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，而平均株高，根瘤數(shù)量可以作為評(píng)價(jià)的參考依據(jù)。

對(duì)紫花苜蓿接種適合其生長(zhǎng)的高效根瘤菌，通過(guò)共生固氮作用，不僅能夠進(jìn)一步提高苜蓿產(chǎn)量，而且還具有很高的生態(tài)效益。所以，對(duì)紫花苜蓿接種適合的根瘤菌，對(duì)促進(jìn)大面積種植紫花苜蓿，進(jìn)一步推動(dòng)我國(guó)農(nóng)業(yè)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

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