王 莉，潘金勇，嵇繼宇，張惠榮（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，新疆石河子832000）

Cornelia de Lange綜合征（CdLS）是一種罕見的先天性疾病，患病率為1/100 000～1/10 000[1]。臨床表現(xiàn)主要為嚴(yán)重的生長發(fā)育遲緩、智力障礙、畸形等[2]。CdLS的患者約60%是NIPBL基因發(fā)生了病理性變化[3]。有研究表明，NIPBL基因水平的高低與CdLS的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4]。Shh基因是由ZRS增強(qiáng)子調(diào)控參與肢芽的發(fā)育[5]，Shh基因在由ZRS增強(qiáng)子調(diào)控的胚胎極化活性區(qū)（ZPA）進(jìn)行肢芽的表達(dá)[6]。然而，在小鼠胚胎發(fā)育階段的肢芽中，NIPBL基因?qū)ξ挥赯PA區(qū)域的Shh基因具有調(diào)控作用，會(huì)影響Shh基因的表達(dá)。但2個(gè)基因之間

的具體交互作用及規(guī)律鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用NIPBL-Loxp小鼠與Cre小鼠雜交，建造NIPBL+/-小鼠模型，探討NIPBL對Shh基因表達(dá)的影響，為CdLS的診斷和干預(yù)提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 NIPBL-Loxp小鼠與Cre小鼠的背景品系小鼠是C57BL/6J，SPF級(jí)，購于浙江大學(xué)，全部小鼠飼養(yǎng)于石河子大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過程遵照石河子大學(xué)《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)管理?xiàng)l例》。挑選NIPBL+/-小鼠雄性體重35 g左右，雌性體重30 g左右，晚上20：00將雌雄小鼠按2∶1合籠，次日早晨8：00檢查雌鼠的陰栓，陰栓陽性者將次日12：00作為其胚胎E0.5天。

1.1.2 儀器與試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT reagent Kit購于Thermo公司；總RNA提取劑Trizol Reagent購于Life公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于Thermo公司；熒光定量試劑盒SYBR Green PCR Kit購于Thermo公司；普通聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀器購于TaKaRa公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀器購于Life公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組 采用NIPBL-Loxp小鼠與Cre小鼠建造NIPBL+/-小鼠模型，NIPBL+/-小鼠與NIPBL+/-小鼠按照雌、雄2∶1合籠進(jìn)行雜交，分別在孕鼠的E10、E11、E12天取出孕鼠放在超凈臺(tái)內(nèi)，以頸部脫臼法處死孕鼠，在嚴(yán)格無菌操作條件下，分別在孕鼠的E10、E11、E12天用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒鑒定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作為實(shí)驗(yàn)組，另選取6只NIPBL+/+胎鼠的肢芽作為對照組，引物設(shè)計(jì)見表1；最后分離胎鼠雙側(cè)四肢，放入液氮15～20 min，再放入-80℃冰箱，以備后期實(shí)驗(yàn)。

表1 NIPBL-Loxp小鼠與Cre小鼠引物信息

1.2.2 采用qRT-PCR檢測Shh基因的表達(dá)情況 Shh基因引物的設(shè)計(jì)見表2。

表2 Shh基因和β-actin的引物信息

1.2.3 實(shí)驗(yàn)組和對照組RNA的提取 按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)組和對照組cDNA的合成 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對上述提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.5 qRT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組Shh基因的表達(dá)情況 以上述cDNA為模板，按照熒光定量試劑盒說明書檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組Shh基因的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊計(jì)量資料的多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NIPBL基因敲除小鼠模型的驗(yàn)證 NIPBL基因敲除打靶載體構(gòu)建策略圖，見圖1。

圖1 野生型及突變型等位基因示意圖

2.2 NIPBL-Loxp和Cre小鼠的引物鑒定結(jié)果 NIPBLLoxp和Cre小鼠建造的NIPBL+/-小鼠模型親代鼠，經(jīng)RT-PCR技術(shù)鑒定出在孕鼠E10、E11、E12天的NIPBL+/-和NIPBL+/+胎鼠，經(jīng)鑒定出來的引物凝膠電泳結(jié)果見圖 2～4。

圖2 NIPBL-Loxp-F/NIPBL-Loxp-R凝膠電泳結(jié)果

圖3 Cre-WT-F/Cre-WT-R凝膠電泳結(jié)果

圖4 Cre-WT-F/Cre-Mut-R凝膠電泳結(jié)果

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組和對照組胎鼠肢芽內(nèi)的Shh基因在E10、11、12天均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組和對照組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因的ΔCt值由大到小依次為E10、E12、E11 天，表明在不同的孕期（E10、E11、E12天）時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因表達(dá)趨勢均為先升后降，即表示實(shí)驗(yàn)組與對照組胎鼠肢芽的Shh基因表達(dá)量在E10天時(shí)有表達(dá)，E11天時(shí)達(dá)頂峰，E12天時(shí)表達(dá)量下降，但仍高于E10天表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組在E10、E11、E12天Shh基因的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。與對照組比較，在相同的孕期（E10、E11、E12天）內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組Shh基因的ΔCt值大于對照組，表明實(shí)驗(yàn)組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因的表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)組與對照組Shh基因ΔCt值的比較（±s）

表3 實(shí)驗(yàn)組與對照組Shh基因ΔCt值的比較（±s）

注：-表示無此項(xiàng)

組別對照組實(shí)驗(yàn)組t P n6 6- -E10天12.448 00±0.006 34 13.056 00±0.015 50-89.149 0.001 E11天9.190 00±0.002 89 10.105 00±0.005 97-337.950 0.001 E12天10.131 00±0.003 43 12.138 00±0.043 30-113.345 0.001

3 討 論

CdLS是一種多系統(tǒng)發(fā)育障礙性的常染色體顯性遺傳疾病[7]。生長發(fā)育遲緩、面部畸形和智力障礙等是CdLS的表型特征，其中生長發(fā)育遲緩是CdLS的重要表現(xiàn)[8]。有關(guān)研究報(bào)道，CdLS受多種基因及信號(hào)通路的調(diào)控，一旦這些基因及信號(hào)通路發(fā)生改變，都可能導(dǎo)致CdLS的發(fā)生。其中，NIPBL基因缺陷是導(dǎo)致CdLS最常見的原因，研究人員利用分子遺傳工具創(chuàng)建了NIPBL基因敲除小鼠，試圖了解CdLS的病因?qū)W[9]。有關(guān)研究報(bào)道，Hedgehog信號(hào)通路抑制劑限制了骨骼的發(fā)育成熟，其包括 Sonic hedgehog（Shh）、Desert hedgehog（Dhh）及Indian hedgehog（Ihh）3 個(gè)配體，其中最常見的是 Shh[10]。Shh基因編碼一種信號(hào)蛋白，在小鼠胚胎肢芽的發(fā)育過程中起不可或缺的作用[11]。Shh基因編碼的Shh蛋白是與ZPA極化功能有關(guān)的一種形態(tài)發(fā)生素，由ZPA中細(xì)胞產(chǎn)生，ZPA區(qū)域傳遞肢芽早期的發(fā)育信號(hào)，啟動(dòng)Shh基因的表達(dá)[12]。有研究表明，小鼠胚胎肢芽中Shh蛋白的變化存在于肢體發(fā)育前10 h，且Shh蛋白量的改變會(huì)影響肢體缺陷的程度[13]。相關(guān)研究顯示，NIPBL在ZPA區(qū)域和肢芽的間充質(zhì)細(xì)胞對Shh基因進(jìn)行調(diào)控，一旦NIPBL基因缺陷，會(huì)引起Shh基因表達(dá)的信號(hào)通路受到抑制，造成Shh基因的表達(dá)缺失，引起ZPA區(qū)域染色體位點(diǎn)異常，從而形成了CdLS的特征性改變[14]。因此，本研究通過建立NIPBL基因敲除模型，進(jìn)一步研究NIPBL和Shh2個(gè)基因之間的相互作用機(jī)制。

有研究報(bào)道，Shh基因通常在正常胎鼠肢芽的E9.5～E11.5天進(jìn)行表達(dá)，且在孕鼠的E10天左右表達(dá)量逐漸增多，在E11天大量表達(dá)，在E12天左右表達(dá)量逐漸減少[15]。本實(shí)驗(yàn)觀察到胎鼠在E9.5天時(shí)仍是個(gè)橢球形，很難分辨出胚胎的器官，Shh基因也幾乎檢測不出表達(dá)；E12.5天時(shí)，胎鼠的肢芽也幾乎檢測不到Shh基因的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取胎鼠的E10、E11、E12天作為實(shí)驗(yàn)分組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在孕鼠的E10、E11、E12天，實(shí)驗(yàn)組和對照組的胎鼠肢芽內(nèi)均有Shh基因的表達(dá)，但是實(shí)驗(yàn)組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因的ΔCt值大于對照組，表明實(shí)驗(yàn)組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因的表達(dá)水平低于對照組（ΔCt值越高，Shh基因的表達(dá)水平越低），說明NIPBL基因缺陷影響胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因表達(dá)的正常信號(hào)通路，抑制了Shh基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組和對照組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因ΔCt值大小依次為E10、E12、E11天，表明在不同的孕期（E10、E11、E12天）內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對照組胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因的表達(dá)趨勢是E10天時(shí)有表達(dá)，但表達(dá)量較少，隨后表達(dá)量逐漸增多，在E11天時(shí)達(dá)到頂峰，隨后表達(dá)量逐漸減少，E12天表達(dá)量較E11天減少，但比E10天表達(dá)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

綜上所述，NIPBL+/-基因敲除抑制胎鼠肢芽內(nèi)Shh基因的表達(dá)，而Shh基因在體內(nèi)正常的軟骨發(fā)育中起重要調(diào)控作用，由此推斷NIPBL+/-基因敲除胎鼠可能會(huì)抑制軟骨的發(fā)育成熟，進(jìn)一步導(dǎo)致CdLS。本研究有助于人們進(jìn)一步了解NIPBL基因在CdLS發(fā)病中的機(jī)制和意義，并為CdLS疾病的診斷和干預(yù)提供新的策略，幫助研究人員深入了解CdLS疾病，以便探索更好的治療方法。

[1]MASKOEN AM，LAKSONO B，HAJJAH R，et al.Cornelia de lange syndrome with thyroid agenesis of an indonesian patient[J].Cell Mol Biol，2017，63（8）：93-94.

[2]INFANTE E，ALKORTA-ARANBURU G，EL-GHARBAWY A，et al.Rare form of autosomal dominant familial Cornelia de Lange syndrome due to a novel duplication in SMC3[J].Clin Case Rep，2017，5（8）：1277-1283.

[3]PUISAC B，TERESA-RODRIGO M，BAQUERO-MONTOYA C，et al.mRNA quantification of NIPBL isoforms a and B in adult and fet al human tissues，and a potentially pathological variant affecting only isoform a in two patients with cornelia de lange syndrome[J].Int J Mol Sci，2017，18（3）：481.

[4]KAUR M，MEHTA D，NOON SE，et al.NIPBL expression levels in CdLS probands as a predictor of mutation type and phenotypic severity[J].Am J Med Genet C Semin Med Genet，2016，172（2）：163-170.

[5]LETTICE LA，DEVENNEY P，DE ANGELIS C，et al.The conserved sonic hedgehog limb enhancer consists of discrete functional elements that regulate precise spatial expression[J].Cell Rep，2017，20（6）：1396-1408.

[6]PELUSO S，DOUGLAS A，HILL A，et al.Fibroblast growth factors（FGFs）prime the limb specific shh enhancer for chromatin changes that balance histone acetylation mediated by E26 transformation-specific（ETS）factors[J].Elife，2017，6（1）：28590.

[7]NEWKIRK DA，CHEN YY，CHIEN R，et al.The effect of Nipped-B-like（Nipbl）haploinsufficiency on genome-wide cohesin binding and target gene expression：modeling Cornelia de Lange syndrome[J].Clin Epigenetics，2017，9（1）：89.

[8]PARENTI I，TERESA-RODRIGO ME，POZOJEVIC JA，et al.Mutations in chromatin regulators functionally Link Cornelia de Lange syndrome and clinically overlapping phenotypes[J].Hum Genet，2017，136（3）：307-320.

[9]KAWAUCHI S，SANTOS R，MUTO AA，et al.Using mouse and zebrafish models to understand the etiology of developmental defects in cornelia de lange syndrome[J].Am J Med Genet C Semin Med Genet，2016，172（2）：138-145.

[10]ROBINSON GW，KASTE SC，CHEMAITILLY W，et al.Irreversible growth plate fusions in children with medulloblastoma treated with a targeted hedgehog pathway inhibitor[J].Oncotarget，2017，8（41）：69295-69302.

[11]AMANO T，SAGAI T，SEKI R，et al.Two types of etiological mutation in the Limb-Specific enhancer of shh[J].G3，2017，7（9）：2991-2998.

[12]MATSUBARA H，SAITO D，ABE G，et al.Upstream regulation for initiation of restricted Shh expression in the chick limb bud[J].Dev Dynam，2017，246（5）：417-430.

[13]ZHANG R，LEE C，LAWSON LY，et al.SHH protein variance in the limb bud is constrained by feedback regulation and correlates with altered digit patterning[J].G3，2017，7（3）：851-858.

[14]MUTO A，IKEDA S，LOPEZ-BURKS ME，et al.Nipbl and mediator cooperatively regulate gene expression to control limb development[J].PLoS Genet，2014，10（9）：1004671.

[15]YOKOYAMA S，F(xiàn)URUKAWA S，KITADA S，et al.Analysis of transcription factors expressed at the anterior mouse limb bud[J].PLoS One，2017，12（5）：0175673.