張尚雄，荊 照，吳菲菲，欒瑞濤，王建麗，張玉霞，王顯國

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193； 2.通遼星圣農(nóng)業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 霍林郭勒 029200；3.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 624400； 4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

飼草高粱作為優(yōu)質(zhì)牧草，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為泌乳奶牛日糧中的玉米(Zeamays)飼草的替代飼料，且不會降低奶牛生產(chǎn)性能[1]，但高粱(Sorghumbicolor)木質(zhì)化程度高，消化率低是其不足之處[2]。褐色中脈(brown mid-rib,BMR)飼草高粱能有效降低木質(zhì)素含量，并且顯著提高消化率[3-4]，其難以消化的木質(zhì)素含量比傳統(tǒng)高粱低40%～60%[5]。目前，褐色中脈飼草高粱改良傳統(tǒng)飼草高粱品質(zhì)已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。有研究報道，BMR飼草高粱比傳統(tǒng)高粱明顯開花早和成熟早，且能提高秸稈的消化率，但籽粒產(chǎn)量顯著低于傳統(tǒng)高粱[6]。BMR飼草高粱年刈割兩次比刈割一次能增加葉莖比，降低莖粗和株高，有效改善BMR品種的飼草品質(zhì)[7]。BMR-12為BMR飼草高粱的品種之一，具有更低的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素含量，相對飼用價值較高，育種潛力較大[8]。BMR飼草高粱不僅可以作為飼草高粱，而且可以作為能源型高粱，有研究表明，BMR飼草高粱低木質(zhì)素含量與生物乙醇產(chǎn)量無關(guān)，但其高葡萄糖含量與生物乙醇正相關(guān)[9]。因此，無論作為飼草高粱，還是能源型高粱，褐色中脈極具潛力。

序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism,SRAP)是一種簡單的分子標(biāo)記系統(tǒng)，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)[10]。國內(nèi)外SRAP標(biāo)記研究植物遺傳多樣性應(yīng)用廣泛，研究發(fā)現(xiàn)，SRAP能高效地分析垂穗披堿草(Elymusnutans)、老芒麥(E.sibiricus)遺傳變異，并區(qū)分遺傳關(guān)系很近的品種。SRAP標(biāo)記技術(shù)的高頻率共顯性以及在基因組中均勻分布的特性優(yōu)于AFLP(amplified fragment length polymorphism)標(biāo)記，并且相對于SSR(simple sequence repeats)，SRAP特異條帶比例較高，并且更加快捷，且成本低[10-12]。研究種質(zhì)資源遺傳多樣性有利于解析材料的遺傳背景和親緣關(guān)系，對正確評價和有效利用種質(zhì)資源、服務(wù)育種實(shí)踐等具有重要意義[13]。為此，本研究對國內(nèi)首次引進(jìn)的21份BMR褐色中脈不育系材料進(jìn)行農(nóng)藝性狀與遺傳多樣性分析，明確不同種質(zhì)材料之間的遺傳關(guān)系，以期為引進(jìn)BMR高粱不育系材料的高效利用及種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。

1 材料與方法

21份試驗材料引自美國[14]，均為BMR飼草高粱不育系(表1)。

1.1 供試材料農(nóng)藝性狀測定方法

試驗地位于內(nèi)蒙古民族大學(xué)，122°27′E，43°62′ N，年均氣溫6～7 ℃，年降水量350～420 mm，土壤類型為沙壤土。試驗小區(qū)隨機(jī)排列，各材料播種5行，行距50 cm，行長6 m，株距15 cm，穴播2～3粒，小區(qū)面積為2.5 m×6 m，保苗1.3×105株·hm-2。各材料之間設(shè)1 m隔離帶，小區(qū)四周均設(shè)保護(hù)行。適時進(jìn)行田間雜草防除，乳熟期測定株高、莖粗、葉寬、莖葉比，采用李源等[8]的方法。

1.2 供試材料遺傳多樣性研究方法

2017年1月16日將試驗材料播種于育苗盤，置于溫室中培養(yǎng)，保證每份材料出苗數(shù)10株以上，于2017年2月22日取樣，每份材料取10個單株幼嫩葉片，剪取等量混合，液氮迅速冷凍保存，放于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。供試材料DNA提取、PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[15-16]，用1%的瓊脂糖凝膠檢測DNA的質(zhì)量和濃度。選取試驗材料農(nóng)藝特性差異較大的5份材料進(jìn)行引物篩選，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，并用自動凝膠成像系統(tǒng)照相保存。引物信息如表2所列。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物相同遷移位置或長度一致的條帶視為1個位點(diǎn)，統(tǒng)計位點(diǎn)總數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，有帶記為1，無帶記為0。試驗采用R 3.4.1進(jìn)行供試材料農(nóng)藝性狀分析，遺傳結(jié)構(gòu)聚類(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)和主成分分析，利用R數(shù)據(jù)包有g(shù)gplot2、cluster、vegan、gclus、scatterplot3d、ape等。

擴(kuò)增帶總數(shù)(total number of bands,TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(number of polymorphic bands,NPB)、多態(tài)性比率(percentage of polymorphic bands,PP)、多態(tài)性信息含量(polymorphic information content,PIC)和標(biāo)記指數(shù)(marker index,MI)的計算方法采用顧曉燕等[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 21份不育系材料農(nóng)藝性狀

試驗表明，BMP448(材料3)株高最高，為138.75 cm，BMP450(材料5)最低，為88.00 cm；BMP17(材料16)莖粗最粗、葉寬最寬，分別為29.97 mm和9.88 cm，說明BMP17的莖粗、葉寬特異性突出。BMP20(材料18)莖葉比顯著高于其他供試材料(P<0.05)，為8.69(表3)。將農(nóng)藝性狀進(jìn)行聚類分析，表明遺傳距離為0.129時，21份材料可分為3類，第Ⅰ類為材料3，材料1、2、5、6、8、9、12、13、15、17為第Ⅱ類，剩余材料為第Ⅲ類(圖1)。

表1 供試材料Table 1 Experimental materials of 21 sorghum germplasm and their pedigrees

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences of SRAP

2.2 SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

130對SRAP引物中，篩選出21對擴(kuò)增效果好，多態(tài)性較高的引物，共擴(kuò)增出74個條帶，有多態(tài)性的64條，每個引物平均擴(kuò)增出3.52個條帶，其中引物的平均多態(tài)性比率為86.5%。21個引物組合的平均PIC值為0.49，其中me13+em4最高，為0.70，而me8+em9的PIC最小，為0.10。引物組合me6+em9標(biāo)記指數(shù)最大，為3.61，而me10+em9的標(biāo)記指數(shù)最小，為0.19(表4)。

2.3 高粱各材料的遺傳相似系數(shù)

通過R語言計算供試材料Jaccard遺傳相似系數(shù)(genetic similarity coefficient，GS)，結(jié)果表明，GS的變化范圍為0.086～0.977，平均GS為0.653。材料BMP447(材料2)和BMP450(材料5)的遺傳相似系數(shù)最近，為0.977，親緣關(guān)系最近，材料BMP455(材料10)和BMP21(材料19)的遺傳相似系數(shù)最小，為0.086，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。供試材料GS頻率表明，GS值在0.6～0.9的共占46.67%，說明近1/2的供試材料遺傳基礎(chǔ)較窄(圖2)。

同列不同小寫字母表示不同材料間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters indicate significant difference among different experimental materials at the 0.05 level.

表4 供試材料SRAP標(biāo)記引物擴(kuò)增結(jié)果Table 4 Amplification results of SRAP primers

圖2 供試材料遺傳相似系數(shù)頻率Fig. 2 Frequency of sample genetic similarity coefficient

2.4 供試材料聚類分析

聚類分析能較好地反映種質(zhì)材料之間的親緣關(guān)系，根據(jù)供試材料遺傳距離進(jìn)行聚類，遺傳距離為0.488時，可將供試材料分為3類，第Ⅰ類為材料19，第Ⅱ類為材料16和20，剩余材料為第Ⅲ類(圖3)。

21份材料聚類后用雙排序矩陣熱圖進(jìn)行驗證(圖4)，從方塊區(qū)域和聚類樹可以看出兩種分類結(jié)果基本一致，不同顏色代表遺傳距離，根據(jù)顏色的深淺度可以看出，遺傳距離較小的顏色為深紅色。聚類樹與聚類熱圖組內(nèi)連接方式不同，導(dǎo)致其分類圖有差異，但對分類結(jié)果無影響。

2.5 供試份材料的主成分分析

根據(jù)主成分特征值大于1表明，21份材料在遺傳組成上分為3個成分，第Ⅲ主成分為19，特征值方差百分比為4.85%，第Ⅱ主成分為16和20，特征值方差百分比為6.25%，其他材料為第Ⅰ主成分，特征值方差百分比為69.22%。3個主成分特征值方差百分比貢獻(xiàn)率(80.32%)大于80%，因此，本研究結(jié)果可用主成分進(jìn)行分析，并且主成分分析與聚類分析的結(jié)果基本一致(圖5)。

2.6 供試份材料農(nóng)藝性狀與遺傳特性的相關(guān)性

21份材料農(nóng)藝性狀各指標(biāo)，以及綜合性狀與分子標(biāo)記的Mantel分析表明，農(nóng)藝性狀及各指標(biāo)與分子標(biāo)記沒有顯著的相關(guān)性，其中莖葉比的相關(guān)性較高，為0.219(表5)。

圖3 21份高粱種質(zhì)的SRAP標(biāo)記聚類結(jié)果 Fig. 3 SRAP markers clusters of the 21 sorghum germplasms

圖4 21份供試材料聚類結(jié)果重排距離矩陣熱圖Fig. 4 Heat map of distance matrix reorder according to the dendrogram of the 21 sorghum germplasms

1，2，3，…21分別代表材料編號，如表1所列，下圖同。

1, 2, 3, …21, material code, at listed in Table 1, similarly for Fig. 5.

3 討論與結(jié)論

飼草高粱農(nóng)藝性狀受遺傳背景、生長環(huán)境、刈割制度的影響，所以遺傳背景不同的BMR飼草高粱及傳統(tǒng)高粱的農(nóng)藝性狀會表現(xiàn)出差異，進(jìn)而影響飼草品質(zhì)性狀，綜合評價農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀，才能篩選出適合特定生長環(huán)境的優(yōu)質(zhì)飼草[2,17]。物種的長期進(jìn)化和適應(yīng)造成遺傳物質(zhì)的改變，產(chǎn)生遺傳變異，而遺傳多樣性是遺傳變異高低最直接的表現(xiàn)形式[13]。本研究引進(jìn)的21份BMR不育系高粱種質(zhì)譜系表明，親本包含OK11、bmr12、bmr6時可將材料分為兩類，材料19、20為一類，其他材料為另一類，這與分子聚類結(jié)果基本相似，由此可見親本差異導(dǎo)致了材料19、20與其他材料的遺傳距離較遠(yuǎn)。而材料15與16親本相同，但遺傳分類較遠(yuǎn)，系譜來源顯示其培育過程不同，可能是導(dǎo)致其遺傳距離較遠(yuǎn)因子之一。因本研究21份BMR不育系高粱種質(zhì)均由人工長期栽培而成，所以不同親本以及復(fù)雜的培育過程使其產(chǎn)生遺傳變異，從而表現(xiàn)出遺傳多樣性。農(nóng)藝性狀各指標(biāo)顯著性方差分析中，材料16莖粗、葉寬最大，材料19與材料20莖粗顯著差異(P<0.05)，而分子標(biāo)記的聚類分析結(jié)果中，材料16、19、20與其他材料不同類，因此推斷莖粗、葉寬可能是影響21份不育系高粱種質(zhì)材料遺傳距離的關(guān)鍵因子。飼草高粱不育系生物產(chǎn)量、莖粗、株高、分蘗等農(nóng)藝性狀受遺傳力加性和非加性效應(yīng)的雙重影響，但遺傳物質(zhì)的作用相對較弱，栽培條件及環(huán)境因子起主導(dǎo)作用[2]。由此可見，本研究21份引進(jìn)材料農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記聚類結(jié)果幾乎不同，并且Mantel分析也證明二者的相關(guān)性較差，這可能與本研究栽培條件和環(huán)境因子有關(guān)。本研究遺傳相似系數(shù)表明，21份引進(jìn)材料近一半遺傳基礎(chǔ)較窄，但材料16、19、20的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，并且這3份材料在莖粗、葉寬等農(nóng)藝性狀方面有突出表現(xiàn)，因此可以根據(jù)分子標(biāo)記和農(nóng)藝性狀聚類對現(xiàn)有資源充分、合理利用，在育種實(shí)踐中培育出新的種質(zhì)，拓寬BMR飼草高粱的遺傳基礎(chǔ)，增強(qiáng)BMR種質(zhì)的利用效率和效果。

遺傳多樣性的探究不僅受物種本身的影響，還有研究方法造成的差異。本研究中21對引物擴(kuò)增出74條帶，多態(tài)性帶的64條，多態(tài)性比率為86.5%。而采用相同標(biāo)記方法，高建明等[18]得出甜高粱的多態(tài)性比率為45.5%，李金旺等[19]得出為97.9%，可見不同材料對SRAP標(biāo)記的特異性表現(xiàn)不同。瓊脂糖電泳和變性聚丙稀酰胺電泳也會影響條帶的顯影，從而影響多態(tài)性分析。

圖5 21份供試材料主成分分析三維排序圖Fig. 5 Three-dimensinal diagram of the 21 samples after PC

分子標(biāo)記特性GeneticcharactersrP株高Plantheight0.0460.326莖粗Diameterofstem0.0330.380葉寬Widthofleaf0.0140.405莖葉比Stem-leafratio0.2190.107農(nóng)藝性狀A(yù)gronomiccharacters0.0850.240

本研究結(jié)果顯示，供試材料中BMP17莖粗、葉寬最大，分別為29.97 mm和9.88 cm。BMP20莖葉比顯著高于其他供試材料(P<0.05)。供試21份褐色中脈不育系高粱種質(zhì)材料共擴(kuò)增出74條譜帶，其中64條有多態(tài)性，多態(tài)性比率為86.5%，多態(tài)性信息含量平均值為0.49。遺傳相似系數(shù)的變化范圍為0.086～0.977。UPGMA聚類分析顯示，遺傳距離為0.488時，可將供試材料分為3類。這表明，所引進(jìn)的BMR飼草高粱不育系材料遺傳基礎(chǔ)較窄。

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