陳虹嬌，李怡心，陳文靜，姚兆群，曹曉蕾，趙思峰

（新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆是我國(guó)最大的優(yōu)質(zhì)商品棉基地，然而因棉田布局集中，在主要棉區(qū)輪作倒茬實(shí)施困難，多年連作導(dǎo)致棉苗爛根病、棉花枯黃萎病等土傳病害發(fā)生普遍且危害日益嚴(yán)重[1-2]。目前防治作物土傳病害的主要方法有農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治、生物防治等，各種方法均有其適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，其中采用浸種、蘸根、灌根、滴灌施用、混土等方式利用生防菌劑防治土傳病害已得到廣泛應(yīng)用[3-5]。然而生防菌在植物根際能否有效定殖是生防菌發(fā)揮穩(wěn)定、持久防病效果的一個(gè)重要因素，也是篩選、評(píng)定土傳病害生防菌的一個(gè)重要指標(biāo)，并最終決定該生防菌是否具有產(chǎn)業(yè)化前景[6]。肖項(xiàng)政等[7]采用氨芐青霉素抗性標(biāo)記評(píng)價(jià)了短小芽孢桿菌BX-4菌株在番茄根部的定殖和對(duì)番茄青枯病的防治情況，發(fā)現(xiàn)該菌株可長(zhǎng)期定殖于番茄根部，對(duì)番茄青枯病的防效達(dá)40%。邱小燕等[6]采用利福平抗性標(biāo)記評(píng)價(jià)了枯草芽孢桿菌515-126菌株在玉米根際的定殖情況及其對(duì)玉米紋枯病的防效。黃秋斌等[8]采用綠色熒光蛋白酶（GFP）基因標(biāo)記評(píng)價(jià)了蠟樣芽孢桿菌B3-7菌株在大田小麥根際的定制動(dòng)態(tài)及其對(duì)小麥紋枯病的防治效果，發(fā)現(xiàn)該菌株可在小麥根部長(zhǎng)期定殖，在小麥分蘗期菌量達(dá)到最大，對(duì)紋枯病有防效達(dá)60%，且具有明顯的增產(chǎn)效果。楊洪鳳等[9]采用利福平抗性標(biāo)記結(jié)合透射電鏡的方法，確定了內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09在小麥根部定殖動(dòng)態(tài)，明確了該菌株能夠在小麥根組織的皮層細(xì)胞、細(xì)胞間隙、中柱鞘及髓腔中定殖，對(duì)小麥赤霉病防效達(dá)到90.3%，展現(xiàn)出了良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期篩選了Bacillus atrophaeusB44和Bacillus subtilisS37兩株菌，經(jīng)盆栽和田間驗(yàn)證，對(duì)棉苗立枯病和棉花黃萎病均表現(xiàn)出良好的防治效果[3-4]，然而其在棉花根部的定殖動(dòng)態(tài)及其與防病效果的關(guān)系一直未明確。本研究采用GFP基因標(biāo)記技術(shù)對(duì)這2株芽孢桿菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，并將標(biāo)記菌株施用到棉花根際，評(píng)價(jià)其在棉苗根部的定殖動(dòng)態(tài)及其對(duì)棉苗立枯病的防效，以期為評(píng)價(jià)其開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌B.atrophaeusB44和B.subtilisS37由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存。

棉花品種為新陸早45號(hào)。

帶有GFP熒光蛋白標(biāo)記及卡那霉素和氨芐青霉素雙重抗性質(zhì)粒PGF4412，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系王琦教授惠贈(zèng)。

SPA 溶液：（500mL）(NH4)2SO40.2 g，K2HPO4·3H2O 1.4 g，KH2PO40.6 g，檸檬酸三鈉二水合物 0.1 g，121℃滅菌 20min。SPB 溶液 ：（500mL） MgSO4·7H2O 0.02 g，121 ℃滅菌 20min。100×CAYE Solution：（100mL）酪蛋白水解物 2 g，Yeast Extract 10 g，121 ℃滅菌20 min。SPI溶液：（100mL） SPA 鹽溶液 49 mL，SPB鹽溶液 49 mL ，（1%V）Glucose（50%W，115 ℃滅菌 20 min）1 mL，（1%V）100×CAYE 1 mL。SPII溶液：（100mL） SPI 溶 液 98 mL，(1%V)50mmol/L CaCl21 mL，（1%V） 250mmol/L MgCl21 mL。

抗生素氨芐青霉素(Amp)和卡那霉素（Km），購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

參照Gao等[10]和李瑞芳等[11]的方法制備2株芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。從-70℃冰箱取出保存菌株，在LB板上劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜進(jìn)行活化，挑取單菌落接種于5mL的SPI溶液，在37℃，200 r/min下?lián)u培過(guò)夜，隨后按10%的接種量，再次轉(zhuǎn)接于10mL的SPI溶液，在37℃，200 r/min下?lián)u培3.5 h后，取全部10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于90mL的SPII溶液，在37℃，100 r/min下?lián)u培90min，隨后在冰上靜置10min后，在4℃ 8000 r/min離心5min收集菌體，并用10mL的SPII溶液重新懸浮菌體，即為感受態(tài)細(xì)胞。將感受態(tài)細(xì)胞加入50%的甘油至10%后，按每管500 μL分裝到離心管中，存入-70℃冰箱，待用。

1.2.2 抗性篩選平板抗性濃度的篩選

為提高芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率，首先對(duì)B44和S37菌株進(jìn)行抗性濃度篩選，以確定轉(zhuǎn)化時(shí)需使用的抗性平板最適濃度。分別配置濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素和卡那霉素溶液。倒板前在200mL的LB培養(yǎng)基中，分別加入2種不同的抗生素，使氨芐青霉素和卡那霉素的終濃度均分別為10 μg/mL，并以5 μg/mL遞增至30 μg/mL的濃度，每種抗生素均設(shè)置5個(gè)濃度梯度。隨后分別取未轉(zhuǎn)化的B44和S37感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行空轉(zhuǎn)對(duì)照，在37℃，200 r/min下?lián)u培2 h，各取200 μL分別涂布于不同抗生素，以及不同濃度梯度的LB平板上，記下菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.3 2株芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證

取出保存的感受態(tài)B44和S37菌株，置于冰上放置5min，待感受態(tài)為溶融狀態(tài)，分別加入0.5 μg的質(zhì)粒PGF4412后混勻，在冰上放置2 min左右，取出在37℃，200 r/min下?lián)u培90min后，涂布于不同抗性的平板，恒溫37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

挑取在抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落，通過(guò)引物G1/G2進(jìn)行PCR驗(yàn)證質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功，用Ra/Rb驗(yàn)證分別驗(yàn)證B44和S37，并送去測(cè)序后與原菌比對(duì)，確定其仍分別為芽孢桿菌B44和S37，并在抗性LB液中搖培后，在熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記效果表現(xiàn)。

表1 本試驗(yàn)采用的引物對(duì)Tab.1 Primers used in this experiment

1.2.4 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性測(cè)試

參照郝慧娟等[12]的方法，挑取PCR驗(yàn)證后的單菌落在抗性LB液中搖培過(guò)夜后，以0.1%接種量，接種于無(wú)抗生素LB液中，在37℃ 200 r/min下?lián)u培7 h，隨后再以0.1%接種量，接種于新的無(wú)抗生素LB液中，于同樣條件培養(yǎng)，如此重復(fù)7次。然后涂布無(wú)抗性LB平板，37℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后，隨機(jī)取100個(gè)菌落，在抗性平板上劃線，以熒光菌株所占百分比計(jì)算標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 標(biāo)記菌株在棉苗根部定殖量及其對(duì)棉苗立枯病的防效

棉花種子在15%的雙氧水中浸泡30min，然后在無(wú)菌水中浸泡8 h后，置于培養(yǎng)皿中，在黑暗條件下放置24 h催芽，直至棉籽露白。將立枯絲核菌菌絲混勻到滅菌蛭石中，濕熱條件下培養(yǎng)24 h，待菌絲均勻長(zhǎng)滿蛭石后，按照1∶1000的質(zhì)量比混勻到滅菌營(yíng)養(yǎng)土中，分裝到營(yíng)養(yǎng)缽中待用。

將2種芽孢桿菌液稀釋至1×107CFU/mL，并將GFP標(biāo)記的2株芽孢桿菌菌液分別稀釋至1×106、1×107和 1×108CFU/mL，隨后各取上述菌液100mL以及無(wú)菌水分別潤(rùn)濕蛭石，并在每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中放置10-15顆露白種子，在其表面覆上一層滅菌營(yíng)養(yǎng)土，進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，每種處理重復(fù)3次。1 d后取芽或根際周圍土壤1 g，用抗性平板回收標(biāo)記菌株，計(jì)算菌株在根際土壤的定殖量，并在每隔5 d取樣1次，直至30 d。待出芽種子露苗，計(jì)算出苗率，同樣取根系1 g，通過(guò)抗性平板回收標(biāo)記菌株，計(jì)算菌株在棉苗根表的定殖量，直至出苗25 d后，統(tǒng)計(jì)棉苗的病情指數(shù)，計(jì)算相對(duì)防效。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100；

相對(duì)防效（100%）=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.7 數(shù)據(jù)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)

用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性平板的濃度篩選

試驗(yàn)結(jié)果表明，未標(biāo)記菌株B44在氨芐青霉素的終濃度達(dá)到15 μg/mL時(shí)，未長(zhǎng)出菌落，而S37菌株在20 μg/mL時(shí)未長(zhǎng)出菌落。卡那霉素終濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)，未標(biāo)記芽孢桿菌B44未長(zhǎng)出單菌落，S37菌株在25 μg/mL濃度時(shí)未長(zhǎng)出單菌落。

2.2 標(biāo)記菌株的獲得與熒光檢測(cè)

分別挑取在氨芐青霉素抗性平板和卡那霉素抗性平板長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，只有在氨芐青霉素抗性板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子是成功標(biāo)記的菌株。對(duì)成功標(biāo)記的菌株B44和S37的進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果也表明轉(zhuǎn)化成功的標(biāo)記菌株是B.atrophaeusB44和B.subtilisS37（見(jiàn)圖1D）。B44菌株在氨芐青霉素抗性板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，原有褶皺丟失（圖1B），而芽孢桿菌S37長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子表面變得光滑半透明，不再有皺縮以及隆起的白色狀物（圖1A）。

圖1 標(biāo)記菌株形態(tài)Fig.1 Morphology of the marked Bacillus

2.3 標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

由圖2可見(jiàn)，在無(wú)抗性選擇壓力存在條件下，隨著傳代次數(shù)增加，標(biāo)記菌株的質(zhì)粒部分丟失，GFP標(biāo)記的遺傳穩(wěn)定性逐漸下降。連續(xù)稀釋培養(yǎng)50 h后，S37與B44遺傳穩(wěn)定性分別為82%和71%，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)條件。

圖2 標(biāo)記菌株的到遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Stability of the marked bacillus

2.4 2株芽孢桿菌在棉花根際定殖情況

通過(guò)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的菌株B44與S37均僅能在棉花根表定殖，但僅在表層粘附，在棉花的根內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到標(biāo)記菌株（圖3）。第7和14天檢測(cè)結(jié)果與第3天一致，2株菌均只定殖于棉花根表面。

圖4 標(biāo)記菌株在根際土壤的定殖量Fig.4 Colonization dynamics of the marked strains on rhizosphere soil

圖3 標(biāo)記菌株在棉花上的定殖Fig.3 Colonization of marked strains on cotton root

2.5 2株芽孢桿菌在棉花根際土壤及根表的定殖動(dòng)態(tài)變化

結(jié)果如圖4。

圖5 標(biāo)記菌株在棉花根表的定殖Fig.5 Colonization dynamics of the marked strains on surface of cotton roots

由圖4可見(jiàn)，兩株菌在根際土壤及根表的定殖量不僅與菌的種類相關(guān)，也與初始濃度相關(guān)。B44在初始濃度為 1×106、1×107和 1×108CFU/g時(shí)，30 d后，土壤中的菌量分別為 1.4×105、8.8×105和4.24×106CFU/g，而其在根表的定殖量分別為9.7×103、1.45×104和 1.43×104CFU/g。S37 在根際土壤中的定殖量相對(duì)高于B44，30d后其在土壤中的菌量分別為 4.3×105、1.26×106和 7.1×106CFU/g，而其在根表的定殖量分別為 9.8×103、2.35×104和2.74×104CFU/g，與 B44相差較小（圖 5）。2株芽孢桿菌均在表現(xiàn)為隨著初始接菌量增加，后期定殖量相比越大。

2.6 不同濃度轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌對(duì)棉苗立枯病的盆栽防效

由表2可見(jiàn)，GFP基因標(biāo)記后的芽孢桿菌S37和B44其防病效果與野生型差異不明顯，野生型菌株S37和B44在1×107CFU/mL時(shí)，其對(duì)棉苗立枯病的防效分別為33.2%和25.4%，而GFP-S37和GFP-B44的防效為30.1%和29.1%。通過(guò)盆栽試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，2株芽孢桿菌對(duì)棉苗立枯病的防效與其定殖量有關(guān)，其中GFP-S37初始接種濃度為1×108CFU/mL時(shí)，防效達(dá)到了51.7%，表現(xiàn)出了良好的防病效果。

表2 2株芽孢桿菌對(duì)棉苗立枯病的防效Tab.2 Control effect of two Bacillus on cotton Rhizoctoniosis

3 討論

對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行GFP標(biāo)記，并觀察其在作物上的定殖情況，在很大程度上促進(jìn)了對(duì)芽孢桿菌與寄主作物、環(huán)境之間相互作用的研究。有研究表明有的芽孢桿菌能夠定植于作物內(nèi)部[13-15]，而有些菌僅在作物根際或根表以及根圍等定殖[16-18]。本研究中，2株芽孢桿菌僅在棉花根外表的粘附定殖，在棉花根內(nèi)部未檢測(cè)到標(biāo)記菌株的存在。就芽孢桿菌本身而言，其不同種之間的菌體大小差異并不顯著，造成定殖位置差異的主要因素應(yīng)與宿主體表分泌物與芽孢桿菌的互作相關(guān)[20]。

不同的芽孢桿菌在作物上的定殖量也不同，張德濤等[19]將芽孢桿菌NB12以3×1010CFU/mL的濃度噴灑到水稻后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在接種水稻7 d，直至20 d時(shí)的定殖菌量高達(dá)106CFU/g，其對(duì)水稻紋枯病的防效也高達(dá)91.3%。黃秋斌等[8]用1×109CFU/mL濃度的蠟樣芽孢桿菌B3-7灌根接種小麥，發(fā)現(xiàn)其在小麥根上的定殖量能達(dá)到105CFU/g，其對(duì)小麥紋枯病有較好的防治效果（60%）。這說(shuō)明初始接種量越高，其定殖量越多，防效較好。本試驗(yàn)中，當(dāng)接種B44濃度為1×106CFU/mL時(shí)，在發(fā)芽種子出苗25 d時(shí)，其在棉花根際土壤的定殖量為1.4×105CFU/g，在棉花根表的定殖菌量基本穩(wěn)定在9.7×103CFU/g，其對(duì)棉苗立枯病的防效為21.7%。接種濃度為1×107CFU/mL時(shí)，相同時(shí)間周期后，其在棉花根際土壤的定殖量為4.24×106CFU/g，在棉花根表的定殖菌量穩(wěn)定在1.43×104CFU/g，其對(duì)棉苗立枯病的防效為34.5%。同樣，S37也表現(xiàn)出初始菌量越高，定殖量越高，防病效果越高的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)Spizizen法，以及對(duì)抗性濃度的篩選，成功將質(zhì)粒PGF4412分別轉(zhuǎn)化進(jìn)芽孢桿菌B.atrophaeusB44和B.subtilisS37進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，并且這2株芽孢桿菌均只能在棉花根表定殖，芽孢桿菌在棉花根際土壤以及根表的定殖量與其對(duì)棉苗立枯病的防效成正比，因此，2株菌具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

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